家蠶性別決定相關(guān)基因Bmhrp28和BmPSI的功能研究.pdf

1、性別決定是生物界基本的科學(xué)問題之一。家蠶屬于鱗翅目昆蟲，其性別決定機制與目前研究的最為清楚的模式昆蟲果蠅相比，既有共同性，也有特殊性，因此家蠶性別決定機制的研究可為我們更好地理解昆蟲性別決定提供一個新的模式。另外，其研究在產(chǎn)業(yè)上也具有重要的應(yīng)用價值。家蠶泌絲結(jié)繭，具有很高的經(jīng)濟價值。家蠶為雌雄異體，而雄蠶的經(jīng)濟價值顯著高于雌蠶。雄繭的平均出絲率要比雌繭高，并且雄蠶體質(zhì)強健、好養(yǎng)、飼料效率高、繭絲品質(zhì)好。因此，家蠶性別決定研究一直是蠶業(yè)的

2、重要課題。本研究利用家蠶的全基因組序列、表達序列標(biāo)簽(ESTs)數(shù)據(jù)以及基因芯片數(shù)據(jù)，對Bmhrp28和BmPSI進行了克隆和分析。同時采用了RT—PCR、原核表達、RNAi、酵母雙雜交、免疫共沉淀等技術(shù)對Bmhrp28和BmPSI的功能進行了研究。主要研究內(nèi)容及結(jié)果如下：
　　 ⑴根據(jù)文獻報道與GenBank登錄的Bmhrp28和BmPSI的基因序列，設(shè)計引物，進行克隆，經(jīng)酶切和測序驗證獲得兩個基因包括完整ORF序列的陽性克隆

3、。在基因結(jié)構(gòu)上，Bmhrp28的ORF長為771 bp，編碼256個氨基酸殘基，預(yù)測其蛋白質(zhì)分子量為28.2 kD，等電點為8.72，位于第21號染色體nscaf3044上，含有7個外顯子、6個內(nèi)含子。而BmPSI的ORF長為2112bp，編碼703個氨基酸殘基，預(yù)測其蛋白質(zhì)分子量為76.4 kD，等電點為6.07，位于第20號染色體nscaf2789上，含有14個外顯子、13個內(nèi)含子。兩個基因的外顯子、內(nèi)含子邊界處均符合GT—AG規(guī)則

4、。蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域分析顯示，Bmhrp28和BmPSI所編碼蛋白均為RNA結(jié)合蛋白。Bmhrp28含有兩個RRM結(jié)構(gòu)域，BmPSI含有四個KH結(jié)構(gòu)域和A、B兩個功能域。RRM和KH結(jié)構(gòu)域均為RNA結(jié)合的區(qū)域，此結(jié)構(gòu)域在RNA的選擇性剪接、加工、轉(zhuǎn)錄等過程中發(fā)揮作用。Bmhrp28和BmPSI蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域部分與果蠅同源基因hrp48和PSI的結(jié)構(gòu)域部分相似性較高，在果蠅中hrp48和PSI作為調(diào)控因子參與P元件轉(zhuǎn)座酶的選擇性剪接。利用家蠶ES

5、Ts數(shù)據(jù)、全基因組芯片數(shù)據(jù)以及半定量RT—PCR方法進行了表達譜分析。ESTs數(shù)據(jù)分析結(jié)果顯示，Bmhrp28和BmPSI均具有EST證據(jù)。在家蠶卵巢細胞、胚胎、卵巢等組織器官中找到Bmhrp28的EST證據(jù)。在家蠶精巢、卵巢、絲腺、胚胎等組織器官中則具有BmPSI的EST證據(jù)。
　　 ⑵為了進一步研究基因功能，我們將Bmhrp28和BmPSI分別連入經(jīng)改造的p28和pET—MBP表達載體進行原核表達。將構(gòu)建好的重組表達質(zhì)粒命名

6、為Bmhrp28/p28和BmPSI/pET—MBP，并將其分別轉(zhuǎn)化到BL21(DE3)表達菌株和Rosetta(DE3)表達菌株。通過IPTG誘導(dǎo)表達，分別得到了分子量約為31 kD和120 kD的重組蛋白，目的蛋白分子量約為28.2 kD和76.4 kD，加上6×His標(biāo)簽序列和MBP標(biāo)簽序列，大小約為31 kD和120 kD，與預(yù)測分子量相吻合。經(jīng)蛋白組分鑒定發(fā)現(xiàn)，誘導(dǎo)表達的兩個重組蛋白均主要以可溶形式表達。通過親和層析和電洗脫的

7、方法分別純化原核表達的BmHRP28和BmPSI蛋白，將純化的蛋白免疫成年健康公兔，制備多克隆抗體。利用western blotting分析表明，BmHRP28和BmPSI的抗體是由其蛋白作為抗原而產(chǎn)生的，可以用做后續(xù)實驗。
　　 ⑶采用體外合成短鏈siRNA介導(dǎo)RNAi的方式，利用家蠶限性白卵早期胚胎(雄)為材料，在產(chǎn)卵后48 h進行顯微注射，后讓其繼續(xù)發(fā)育到96 h進行熒光定量PCR檢測在干擾Bmdsx上游基因Bmhrp28

8、和BmPSI后，Bmdsx下游基因PBP、SP1和Vg的表達差異，進而對Bmhrp28和BmPSI在家蠶性別決定中的功能進行研究。研究結(jié)果顯示，干擾BmPSI，下游基因PBP表達量降低，SP1和Vg表達量增加，暗示BmPSI作為Bmdsx上游調(diào)控因子在家蠶性別決定路徑中具有重要作用。而干擾Bmhrp28，下游基因PBP表達量雖然也有所降低，但SP1和Vg的表達量并未增加。我們推測Bmhrp28作為Bmdsx的上游調(diào)控因子雖然同樣參與了家

9、蠶性別決定路徑，但是功能可能弱于BmPSI。
　　 ⑷為確定Bmhrp28與BmPSI的相互關(guān)系，采用酵母雙雜交和免疫共沉淀的方法進行研究。首先利用酵母雙雜交技術(shù)，在無自激活的前提下，將待檢測的目標(biāo)基因共轉(zhuǎn)酵母，通過檢測三個報告基因(HIS3、URA3、LacZ)是否表達從而確定目標(biāo)基因之間的相互關(guān)系。本研究中，首先將Bmhrp28連入pPC86載體(AD)，BmPSI連入pDBLeu載體(BD)。在檢測無自激活后，將pPC86

10、—Bmhrp28和pDBLeu—BmPSI共轉(zhuǎn)酵母。結(jié)果顯示，在SC/—Leu—Trp—His+3—AT平板與SC/—Leu—Trp—ura平板上均無可生長的陽性克隆，在LacZ膜檢中無顯藍色的陽性結(jié)果，即HIS3、URA3、LacZ三個報告基因均未檢測到表達。由此可見Bmhrp28與BmPSI之間沒有直接相互作用或者相互作用極弱。為了進一步驗證該結(jié)果，我們采用免疫共沉淀檢測Bmhrp28與BmPSI之間的相互關(guān)系。首先以精巢組織抽提物

11、為材料，加入BmHRP28抗體去沉淀其抗原，與BmHRP28相互作用的其它蛋白也會一并沉淀下來，再用BmPSI抗體檢測沉淀蛋白產(chǎn)物中是否存在BmPSI。結(jié)果顯示，BmHRP28抗體沉淀的蛋白產(chǎn)物中，既存在BmHRP28，也存在BmPSI。結(jié)合之前酵母雙雜交的結(jié)果表明，Bmhrp28與BmPSI并不是直接相互作用，而是共存于一個蛋白復(fù)合體在家蠶性別決定路徑中行使功能。
　　 ⑸構(gòu)建了酵母雙雜交早期胚胎cDNA文庫。此文庫以家蠶限性

12、白卵品種(雄)為材料，將cDNA連入pDONR222載體，產(chǎn)生Gateway入門文庫。隨后將入門文庫轉(zhuǎn)到pDEST22載體上，獲得酵母雙雜交cDNA文庫。經(jīng)鑒定，該文庫的總克隆數(shù)為1.36×107。從平板上隨機挑取40個轉(zhuǎn)化子菌落，提取文庫質(zhì)粒DNA進行PCR檢測。結(jié)果顯示，該文庫插入的平均片段大小大于1.3 kb，重組率大于95％。取文庫1μL稀釋106倍后涂板檢測，共長出77個菌落。擴增后的文庫效價為7.7×1010cfu/mL。鑒

13、定結(jié)果表明，該文庫達到構(gòu)建文庫的標(biāo)準(zhǔn)，可以用做下一步文庫的篩選。采用酵母雙雜交的方法，在無自激活的前提下，將pDBLeu—BmPSI篩選已構(gòu)建的家蠶酵母雙雜交早期胚胎cDNA文庫。菌落在SC/—Trp/—Leu/—His+30mM3—AT平板上生長7天后，共長出22個酵母轉(zhuǎn)化菌落。將酵母菌落在SC—Trp—Leu二缺平板上劃線保種，并挑取少量菌落檢測LacZ報告基因的表達。通過LacZ檢測的陽性克隆在SC—Trp—Leu—Ura平板上劃