家蠶性別決定重要因子Masc蛋白的性質(zhì)研究.pdf

1、家蠶（bombyx mori）作為一種鱗翅目昆蟲，可作為模式生物研究其生命活動的調(diào)節(jié)機制，產(chǎn)出的絲對農(nóng)業(yè)生產(chǎn)具有重要經(jīng)濟效益，同時也是開發(fā)新一代生物反應器和新型昆蟲產(chǎn)業(yè)的經(jīng)典材料。農(nóng)耕立國，養(yǎng)蠶與種桑一直是我國古代至近代農(nóng)業(yè)的重要組成部分，我國的人工養(yǎng)蠶史已經(jīng)有5000多年，絲綢之路也成為中外經(jīng)濟、文化交流的重要通道。2003年底，我國率先完成了家蠶基因組框架圖的繪制工作，獲得了大量重要的家蠶基因組信息，這使我國在家蠶功能基因組研究方面

2、處于先進和有利地位。通過家蠶這一重要模式生物的功能基因組研究，將促進絲綢產(chǎn)業(yè)的發(fā)展、拉動農(nóng)林相關學科發(fā)展、促進以家蠶為代表的昆蟲產(chǎn)業(yè)開發(fā)、并推進生命科學基礎研究的進程。
　　而對于家蠶性別的研究無論在生產(chǎn)上還是在害蟲的防治上都具有重要意義。據(jù)研究報道，由于雄蠶不需要參與產(chǎn)卵過程，它們的產(chǎn)絲量要遠遠大于雌蠶。因此在生產(chǎn)中調(diào)節(jié)家蠶性別比例，使雄蠶的數(shù)量增加，可以大大提高產(chǎn)絲量，對蠶絲的產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)具有重要意義。家蠶作為一種模式昆蟲，研究

3、其性別調(diào)控可以通過控制雄蠶的數(shù)量進而控制家蠶的繁殖量，繼而達到鱗翅目害蟲防治的目的。
　　從分子生物學水平研究家蠶性別決定的機制可以為農(nóng)業(yè)生產(chǎn)提供基礎理論和參考。因此，對于家蠶性別決定的基因研究就顯得尤為重要。到目前為止，很多性別相關的基因被鑒定出來，其中對性別決定起主導作用的基因為Bmdsx基因。研究Bmdsx基因與其它基因的相互作用對進一步探究家蠶的性別調(diào)控具有推動作用。其中，Masc在2014年被發(fā)現(xiàn)，該基因可以與家蠶性別調(diào)

4、控初始基因Fem相互作用，調(diào)控著下游Bmdsx基因的選擇性剪切，從而決定家蠶的性別分化。盡管研究人員已經(jīng)知道Masc在家蠶性別決定過程中起著重要作用，然而目前對Masc蛋白本身的性質(zhì)卻報道甚少。
　　因此，我們選取Masc作為研究對象，對其進行了生物信息學分析，并克隆包含兩個CCCH-type鋅指結構和含有部分卷曲結構的domain區(qū)域并進行了蛋白的原核表達及純化；進而對該上清活性蛋白進行二級結構分析，并在這兩個蛋白區(qū)段中選取特異

5、性較強的功能區(qū)制備了多克隆抗體；利用RT-PCR和熒光定量PCR技術探究Masc在家蠶各組織的表達特征，同時對其生殖腺的蛋白表達水平進行檢測；然后又對其在細胞及組織的表達進行定位；最后通過IP及質(zhì)譜鑒定探究Masc與其它蛋白的相互作用。獲得的主要結果如下：
　　1、Masc的生物信息學分析；
　　根據(jù)文獻報道，家蠶Masc在NCBI中的登錄號為AB840788.1。經(jīng)分析，Masc的mRNA全長為2075 bp，其中CDS序

6、列長度為1767 bp，5’非翻譯區(qū)（5’UTR）的長度為146 bp，3’非翻譯區(qū)（3’UTR）的長度為162 bp。Masc基因定位于Z染色體上。
　　通過生物信息學分析，結果顯示其編碼588個氨基酸；蛋白質(zhì)理論分子量為64.71 kD，等電點為9.69，屬于堿性蛋白。同源性檢索結果顯示其與大紅斑蝶的同源性最高，但與其它物種的同源性都較低。采用SMART程序進行結構域預測，結果顯示Masc蛋白第48到73和第79到105區(qū)段分

7、別為兩個含有CCCH-type的鋅指結構域。
　　利用家蠶全基因組芯片表達譜數(shù)據(jù)分析顯示，該基因的芯片探針號為sw18123；芯片表達譜數(shù)據(jù)顯示Masc在精巢和卵巢中具有表達信號，其中精巢的信號值要顯著大于卵巢。
　　2、Masc的domain區(qū)的克隆、原核表達、蛋白純化、二級結構分析及抗體制備；
　　取家蠶5齡3天的精巢進行研磨并抽提總RNA，將其反轉為cDNA作為模板。對Masc的CDS序列的domain區(qū)進行序列

8、分析，選取第135 bp到435bp、第900 bp到1305 bp的兩個區(qū)域分別設為domain1區(qū)和domain2區(qū)，并設計引物。以cDNA為模板，利用自己設計的引物進行PCR，最終克隆得到兩個區(qū)域的基因片段，并通過瓊脂糖凝膠電泳及膠回收的方式進行片段回收，將回收到的片段雙酶切并用T4連接酶將其與pET-28a的表達載體相連獲得重組載體，再導入到大腸桿菌感受態(tài)Transetta菌株中，優(yōu)化表達條件并原核表達獲得蛋白。
　　對d

9、omain1區(qū)表達的蛋白進行凝膠過濾層析的純化及圓二色譜的測定，圓二色譜法分析可得Masc的domain1區(qū)表達的蛋白含有豐富的β-折疊的結構，這與其具有鋅指結構的結果相符?？紤]到domain2區(qū)段的特異性較好，故domain2區(qū)表達的蛋白送入公司制備抗體，獲得了0.62mg/mL的多克隆抗體，效價為1:500000，通過western blotting的檢測結果顯示該抗體的單一性良好，可以進行后續(xù)實驗。
　　3、Masc在RNA

10、及蛋白水平的組織表達特征分析；
　　采用RT-PCR、熒光定量PCR進行Masc各組織間表達水平的檢測，結果顯示Masc在家蠶5齡3天的生殖腺中表達，其中在精巢中高量表達，而在卵巢中也能檢測到其表達，但表達量較低。生殖腺的蛋白定量結果也顯示，Masc蛋白在生殖腺中的精巢表達量較高，這個結果與RNA水平的表達結果一致。這些結果說明Masc在生殖腺中可能發(fā)揮著重要作用。
　　4、Masc在細胞及組織的表達定位分析；
　　為

11、了進一步研究Masc的性質(zhì)，本論文進行了Masc的表達定位研究。首先，將Masc的全長CDS進行克隆并在N端加入Myc融合標簽，然后連接到真核表達載體1180[Hrs1000-BmAct4-LUC-Ser1PA]上，獲得重組真核表達載體1180[Hrs1000-BmAct4-Myc-Masc-LUC-Ser1PA]，轉染BmE細胞中進行表達，采用Myc標簽抗體進行雜交。結果顯示，Masc在BmE細胞中主要定位于細胞質(zhì)。為了進一步確認亞細

12、胞定位結果，我們采用Masc抗體進行雜交，結果顯示Masc蛋白在BmE的細胞質(zhì)中同樣具有很強的信號。
　　然后，我們進行了Masc蛋白在生殖腺組織的表達情況研究。免疫熒光實驗結果顯示，Masc主要在結締組織層、精原細胞、生精囊和精子束中均有表達。其中，該蛋白在精子束中主要定位在細胞核；而在生精囊中主要定位在細胞質(zhì)；在結締組織層中主要定位在細胞質(zhì)。這些結果暗示Masc在精巢中可能發(fā)揮著多種功能。
　　5、Masc與其它蛋白的相

13、互作用分析；
　　為了獲得新的與Masc相互作用的蛋白，本論文進行了Masc的免疫沉淀實驗。Masc-IP實驗及質(zhì)譜鑒定的結果顯示，一共鑒定了185種蛋白，分別在66個蛋白組中。其中與家蠶性別決定相關的蛋白有2個，分別是Ago3和Siwi蛋白。這些結果暗示Masc蛋白可能同參與ping-pong機制并含有Piwi功能域的Ago3和Siwi蛋白結合，參與性別調(diào)控的過程。下一步我們將通過Co-IP實驗驗證Masc與Ago3及Siwi相