BmCycH基因及其在家蠶中表達(dá)特性的研究.pdf

1、細(xì)胞周期依賴性蛋白激酶(Cdk7)是后生動(dòng)物Cdk激酶(CAK)重要的催化、調(diào)節(jié)亞基,而Cdk的激活需要自身結(jié)合一個(gè)調(diào)節(jié)亞基,也就是細(xì)胞周期蛋白H(cyclin H)。在哺乳動(dòng)物體內(nèi),cyclin H與Cdk7、MAT1形成的三元復(fù)合物具有CAK激酶的活性,它能磷酸化某些Cdk T環(huán)內(nèi)保守的蘇氨酸殘基,繼而行使Cdk的作用。目前,國(guó)內(nèi)外對(duì)cyclin H的研究大多集中在脊椎動(dòng)物上,而對(duì)無脊椎動(dòng)物的研究較少。
　　 通過RT-PC

2、R的方法從家蠶蛹中擴(kuò)增到家蠶cyclin H基因完整的ORF序列,GenBank No.AV406047,將其命名為家蠶細(xì)胞周期蛋白H(Bombyx mori Cyclin H,BmCycH)。該基因序列長(zhǎng)為753bp,編碼250個(gè)氨基酸殘基,預(yù)測(cè)分子量為28.34kD。將擴(kuò)增到的BmCycH基因克隆到重組表達(dá)載體pET-28a(+)相應(yīng)的酶切位點(diǎn)上,構(gòu)建重組蛋白表達(dá)質(zhì)粒pET-28a(+)-BmCRcH,經(jīng)PCR、酶切鑒定以及序列分析

3、證明重組正確。將該重組子轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(DE3),用終濃度為1mmol/L的IPTG誘導(dǎo)工程菌表達(dá)重組蛋白,裂解菌體作SDS-PAGE分析,在32kD左右的位置有一條特異性蛋白條帶,與預(yù)期值相符。重組蛋白以包涵體形式存在,將超聲裂解菌體后12000rpm離心所得到的沉淀溶于N-十二烷基肌氨酸鈉中,并以親和層析的方法純化目的蛋白His-tag BmCycH。以純化蛋白為抗原免疫雄性新西蘭兔,制備了該重組蛋白的多克隆抗體,ELISA檢

4、測(cè)該抗血清的效價(jià)可達(dá)1:12800以上。
　　 利用熒光定量PCR技術(shù),分析家蠶各個(gè)發(fā)育時(shí)期,以及五齡幼蟲不同組織的靶mRNA的量。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,BmCycH蛋白在家蠶各個(gè)時(shí)期都有表達(dá),蛾、蛹、幼蟲和卵表達(dá)量依次降低;BmCycH蛋白在家蠶五齡幼蟲不同組織也均有表達(dá),在頭部表達(dá)量最高,絲腺表達(dá)量最低。提取家蠶各個(gè)時(shí)期以及五齡幼蟲不同組織的蛋白,用于Western blotting實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明各個(gè)時(shí)期蛋白表達(dá)量與熒光定量PC