免疫誘導(dǎo)家蠶血淋巴的抗菌與抗腫瘤活性研究.pdf

1、家蠶，是一種典型經(jīng)濟(jì)昆蟲。家蠶生命周期由蠶卵、幼蟲、蠶蛹、成蟲四個(gè)階段組成。家蠶各階段形態(tài)、生理機(jī)能完全不同，屬于完全變態(tài)生物。家蠶按化性可分為一化性、二化性、多化性品種?；圆煌Q的大小、體質(zhì)、繭質(zhì)存在差異，對(duì)不良環(huán)境的適應(yīng)能力由強(qiáng)到弱依次為多化性、二化性、一化性。據(jù)商務(wù)部辦公廳統(tǒng)計(jì)，2013年我國(guó)桑蠶種發(fā)放數(shù)量1655萬(wàn)張，桑蠶繭產(chǎn)量65萬(wàn)噸，桑蠶絲產(chǎn)量13.4萬(wàn)噸。家蠶幼蟲主要通過(guò)食桑攝取、存儲(chǔ)食物營(yíng)養(yǎng)，為吐絲結(jié)繭提供蠶絲原材料

2、。除此之外，家蠶幼蟲已用于生物反應(yīng)器、基因工程、醫(yī)藥等方面的研究。其中，感染白僵菌形成的白僵蠶的醫(yī)藥價(jià)值早在李時(shí)珍的《本草綱目》就有記載：滅諸瘡瘢痕、主治小兒驚癇夜啼、瘰疬、頭風(fēng)、風(fēng)蟲齒痛、散風(fēng)痰結(jié)核等。將家蠶幼蟲感染蟲草孢子獲取具有藥用價(jià)值的蠶蟲草也獲得了越來(lái)越多的關(guān)注。家蠶幼蟲血淋巴在抗腫瘤、抗菌、抗病毒、抗凋亡組分引起的細(xì)胞凋亡、凝集作用、可作昆蟲細(xì)胞培養(yǎng)基等方面已有報(bào)道。然而，針對(duì)不同化性家蠶經(jīng)不同外源物質(zhì)刺激免疫后的血淋巴的生

3、物醫(yī)學(xué)功能研究，目前尚無(wú)研究?；诖?，本論文以大腸桿菌、腫瘤細(xì)胞、生理鹽水等刺激不同化性家蠶，收集免疫血淋巴。分析其理化性質(zhì)并研究它們對(duì)細(xì)菌、哺乳動(dòng)物紅細(xì)胞凝集、腫瘤細(xì)胞增殖、小鼠急性毒理的影響，更深入地挖掘家蠶血淋巴潛在的藥用功效，探究其在生物醫(yī)學(xué)上的新用途。
　　課題主要由兩方面組成：免疫家蠶血淋巴的采集及后處理、理化性質(zhì)、凝集作用、抗菌、體外抗腫瘤、體內(nèi)急性毒理性等生物醫(yī)學(xué)活性研究。主要內(nèi)容包括：
　?。?）首先通過(guò)細(xì)

4、菌、腫瘤細(xì)胞、生理鹽水注射到一化性、二化性5齡家蠶血腔中，免疫24 h，不做任何處理的作為空白對(duì)照。免疫誘導(dǎo)結(jié)束后，大批量收集不同化性家蠶血淋巴，并作離心、熱處理及冷凍干燥等工藝處理。
　?。?）其次對(duì)后處理的血淋巴進(jìn)行理化性質(zhì)包括pH、光譜吸收、質(zhì)量分?jǐn)?shù)等檢測(cè)。pH計(jì)測(cè)其酸堿度值；紫外分光光度計(jì)測(cè)定7種血淋巴在190-900 nm的吸收光譜；冷凍干燥后，由前后質(zhì)量差計(jì)算它們的質(zhì)量分?jǐn)?shù)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，不同化性家蠶經(jīng)過(guò)不同誘導(dǎo)免疫后，血

5、淋巴均呈弱酸性。約250 nm處均有一個(gè)吸收峰，吸光度值最小的是二化性的細(xì)菌處理組，僅為1.3左右；其次是一化性的正常組，吸光度值約為1.4；其余5種誘導(dǎo)免疫組較大且統(tǒng)一，吸光度值約為1.6。而在430 nm處，兩種化性的菌免疫組及一化性的細(xì)胞免疫組出現(xiàn)一個(gè)新的波峰。
　?。?）通過(guò)玻片法、96孔板法測(cè)定血淋巴與鼠、兔、人、豬等哺乳動(dòng)物紅細(xì)胞的體外凝集反應(yīng)。玻片法測(cè)定結(jié)果是7種血淋巴對(duì)鼠、兔紅細(xì)胞均有凝集作用，96孔板法檢測(cè)結(jié)果是

6、除了UCT-SH沒(méi)有凝集素活力外，其他6組均具不同程度的凝集素活力。
　?。?）抑菌圈試驗(yàn)、微量稀釋法及菌生長(zhǎng)曲線試驗(yàn)等分別定性、定量測(cè)定家蠶血淋巴對(duì)細(xì)菌的抑殺效果，測(cè)定抑菌圈直徑、最小抑菌濃度及菌的生長(zhǎng)曲線變化等指標(biāo)。抑菌圈試驗(yàn)結(jié)果表明7種家蠶血淋巴對(duì)金黃色葡萄球菌無(wú)抑菌作用，只有菌免疫誘導(dǎo)的兩種化性家蠶血淋巴具有抑制大腸桿菌活性，且具有熱穩(wěn)定性。50-100℃范圍內(nèi)UBT-SH的MIC均小于5.96 ng/mL，UBT-SH隨

7、著溫度升高M(jìn)IC逐漸減小。7種家蠶血淋巴均可降低大腸桿菌E.coli K12D31生長(zhǎng)曲線。
　?。?）通過(guò)靜態(tài)、動(dòng)態(tài) MTT及流式細(xì)胞凋亡試驗(yàn)研究家蠶血淋巴對(duì)腫瘤細(xì)胞增殖的影響，觀察細(xì)胞形態(tài)、計(jì)算細(xì)胞增殖抑制率、凋亡率等分析家蠶血淋巴對(duì)腫瘤細(xì)胞的體外作用，研究結(jié)果表明，家蠶血淋巴可改變細(xì)胞形態(tài)，促使細(xì)胞變圓、皺縮，能抑制SW1990和MCF7細(xì)胞的生長(zhǎng)，各時(shí)間及濃度下的UCT-SH均表現(xiàn)腫瘤生長(zhǎng)抑制作用。
　?。?）通過(guò)瓊

8、脂培養(yǎng)法體外培養(yǎng)MDA-MB-231多細(xì)胞腫瘤球體，并繪制腫瘤球體生長(zhǎng)曲線。研究7種家蠶血淋巴對(duì)MDA-MB-231多細(xì)胞腫瘤球體成型后的影響，主要觀察多細(xì)胞腫瘤球體形態(tài)及體積的變化趨勢(shì)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，瓊脂培養(yǎng)法可成功構(gòu)建MDA-MB-231多細(xì)胞腫瘤球體。MTS0-8 h緩慢生長(zhǎng)、16-20 h快速增大、20-38 h增長(zhǎng)平緩且趨于穩(wěn)定，平均體積約為1.0 mm3。7種家蠶血淋巴可影響MT S形態(tài)，腫瘤球體邊緣呈棉絮狀，透亮細(xì)胞消失。

9、與對(duì)照組相比，7種家蠶血淋巴能減緩MTS增幅，UBT-SH和BNS-SH組的MTS體積增長(zhǎng)比率低于1，即這兩組血淋巴可減小腫瘤體積。
　　（7）一化性、二化性家蠶血淋巴在6 h內(nèi)分別按劑量15000 mg/kg、5001 mg/kg灌胃BALB/c小鼠，研究這些血淋巴對(duì)BALB/c小鼠的急性毒理作用。觀察小鼠活動(dòng)狀態(tài)、稱量體重、檢測(cè)肝腎功能、血常規(guī)、解剖尸體并觀察各臟器組織等指標(biāo)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，實(shí)驗(yàn)組各指標(biāo)與陰性對(duì)照組比較均無(wú)顯著