家蠶鳥(niǎo)苷三磷酸環(huán)化水解酶(BmGTPCH)基因在黑色素代謝過(guò)程中的功能研究.pdf

1、鳥(niǎo)苷三磷酸環(huán)化水解酶(GTP CyclohydrolaseⅠ,GTPCH,EC3.5.4.16)是一種具有GTP-cyclohydro結(jié)構(gòu)域的蛋白酶,廣泛存在于脊椎動(dòng)物和無(wú)脊椎動(dòng)物。GTPCH蛋白酶是以鳥(niǎo)苷三磷酸為底物,最終形成四氫生物喋呤(BH4)反應(yīng)的限速酶。在哺乳動(dòng)物,BH。缺乏將引起苯丙酮尿癥、抑郁癥、多巴肌張力障礙、老年癡呆癥、高血壓、糖尿病、動(dòng)脈粥樣硬化等疾病。在昆蟲(chóng),果蠅的GTPCH基因突變將影響胚胎黑化及硬化而致死,柑橘

2、風(fēng)蝶的GTPCH基因與幼蟲(chóng)體表黑色斑紋形成有關(guān)。有實(shí)驗(yàn)證明家蠶鵯斑(quail)突變體個(gè)體內(nèi)的GTPCH酶活性比正常個(gè)體高,但至今還沒(méi)有直接關(guān)于GTPCH基因在家蠶黑色素合成中發(fā)揮作用的報(bào)道。家蠶作為鱗翅目模式昆蟲(chóng),研究GTPCH基因在黑色素合成代謝過(guò)程中的功能作用,對(duì)揭示家蠶黑色素合成代謝的分子機(jī)制,探索防治農(nóng)業(yè)病蟲(chóng)害新途徑具有重要意義,同時(shí)為控制與治療人類疾病提供參考。
　　 本研究基于家蠶基因組數(shù)據(jù)庫(kù),利用生物信息學(xué)、RT

3、-PCR、活體注射、離體組織培養(yǎng)以及HPLC等技術(shù)手段,探索GTPCH在家蠶黑色素合成代謝中的功能作用。研究獲得的主要結(jié)果如下:
　　 1.家蠶GTPCH基因生物信息分析及表達(dá)研究
　　 序列分析顯示:家蠶GTPCH氨基酸序列與柑橘鳳蝶同源性最高為94%、赤擬谷盜次之為73%、人類最低為4896。不同物種間GTPCH氨基酸同源保守序列位于GTP-cyclohydro功能結(jié)構(gòu)域。
　　 芯片數(shù)據(jù)顯示:GTPCH基因

4、在家蠶5齡3天的生殖腺中有高量表達(dá),在頭、絲腺、血液和脂肪體中也有一定表達(dá),在表皮、中腸和馬氏管中有少量表達(dá)或不表達(dá),這結(jié)果與苯丙氨酸羥化酶(PAH)基因的芯片數(shù)據(jù)分析獲得的表達(dá)模式比較相似。
　　 RT-PCR結(jié)果顯示:在家蠶5齡3天幼蟲(chóng)的組織中,亞型GTPCHa在頭部組織有表達(dá),在血液、馬氏管、中腸、絲腺、精巢、卵巢、氣管、脂肪體、表皮等組織沒(méi)有發(fā)現(xiàn)表達(dá),表達(dá)模式與TH高度相似;亞型GTPCHb在脂肪體有高量表達(dá),在頭、精巢

5、、卵巢和血液等組織有比較明顯的表達(dá)電泳帶,在馬氏管的表達(dá)量很少,在氣管沒(méi)有發(fā)現(xiàn)表達(dá),表達(dá)模式與PAH高度相似。在4齡入眠不同發(fā)育時(shí)期中,亞型GTPCHa在入眠12 h、18 h和24 h等時(shí)期有表達(dá),在剛?cè)朊吆腿朊? h等時(shí)期沒(méi)有發(fā)現(xiàn)表達(dá),表達(dá)模式與TH高度相似;亞型GTPCHb在入眠后5個(gè)發(fā)育時(shí)期都有表達(dá),表達(dá)模式幾乎與PAH一致。相似的表達(dá)模式暗示GIPCH可能與TH和PAH的功能有關(guān)。
　　 2.抑制GTPCH活性對(duì)家蠶幼

6、蟲(chóng)斑紋黑色素合成的影響
　　 利用家蠶幼蟲(chóng)各齡眠時(shí)形成新表皮以及重新合成黑色素分布于新表皮上形成固有的體色斑紋,和普通斑幼蟲(chóng)半月紋黑色素多以及半月紋對(duì)稱地分布在背中線左右兩側(cè)便于觀察比較等特點(diǎn),用GTPCH酶的特異抑制劑活體注射胸部已進(jìn)入膨大的三齡或四齡幼蟲(chóng)的右側(cè)半月紋,觀察蛻皮后幼蟲(chóng)背部半月紋的變化,與同一個(gè)體未注射的左側(cè)半月紋相比較,有右側(cè)半月紋著色淺(斑紋色淡)、著色范圍縮小(斑紋缺失)甚至不著色(斑紋完全消失)的陽(yáng)性個(gè)體

7、發(fā)生,陽(yáng)性發(fā)生率在2個(gè)注射濃度共6個(gè)重復(fù)試驗(yàn)中都達(dá)到85%以上。這個(gè)結(jié)果說(shuō)明抑制了GTPCH活性將影響黑色素正常合成,即GTPCH活性與家蠶黑色素合成有關(guān)。
　　 3.一個(gè)便于研究色素代謝的眠蠶體壁組織培養(yǎng)方法
　　 以4齡入眠后體壁組織為實(shí)驗(yàn)材料,探索適宜研究家蠶色素代謝的幼蟲(chóng)體壁組織培養(yǎng)方法.結(jié)果表明:含10%優(yōu)等牛胚胎血清的Grace培養(yǎng)基適于幼蟲(chóng)體壁組織培養(yǎng),培養(yǎng)溫度為26℃:取入眠11～12 h后剝?nèi)ヅf表皮的半

8、月紋處的體壁組織更容易觀察色素代謝的外觀性狀變化,培養(yǎng)24 h后,剛毛再生和色素沉積是易于觀察的色素代謝變化標(biāo)志性狀。通過(guò)眠蠶離體培養(yǎng)體壁組織的黑色素合成抑制試驗(yàn)觀察到的體壁外觀性狀變化,證明了酪氨酸羥化酶催化酪氨酸轉(zhuǎn)化成多巴是家蠶黑色素合成代謝途徑上的重要反應(yīng)步驟。
　　 4.GTPCH在家蠶黑色素合成中作用的分子機(jī)制
　　 對(duì)4齡入眠11～12 h剝?nèi)ヅf表皮的半月紋處的體壁組織分類培養(yǎng)觀察,結(jié)果顯示:(1)培養(yǎng)基中加

9、入GTPCH抑制劑培養(yǎng)的體壁沒(méi)有黑色素形成,這個(gè)結(jié)果再次驗(yàn)證了抑制GTPCH酶活性就能抑制黑色素合成,即GTPCH參與了家蠶黑色素合成。(2)培養(yǎng)基中同時(shí)加入GTPCH抑制劑和BH4培養(yǎng)的體壁有黑色素沉積形成,即在GTPCH滅活的條件下,補(bǔ)充BH4能讓黑色素合成代謝正常進(jìn)行,說(shuō)明在家蠶黑色素合成過(guò)程中,GTPCH的作用是提供BH4或GTPCH是通過(guò)提供BH4來(lái)參與家蠶黑色素合成代謝的.(3)培養(yǎng)基中同時(shí)加入GTPCH抑制劑和phe培養(yǎng)的

10、體壁,與培養(yǎng)基中同時(shí)加入GTPCH抑制劑和tyr培養(yǎng)的體壁均沒(méi)有黑色素形成,而培養(yǎng)基中同時(shí)加入GTPCH抑制劑和dopa培養(yǎng)的體壁有黑色素沉積形成,即在GTPCH滅活的條件下,phe和tyr不能衍生成黑色素,但dopa能衍生成黑色素,或者說(shuō)在GTPCH滅活的條件下,phe和tyr不能衍生成黑色素的原因在于它們不能衍化成dopa,因此,phe和tyr衍化成dopa需要BH4。(4)培養(yǎng)基中同時(shí)加入GTPCH抑制劑、PAH抑制劑以及BH4培

11、養(yǎng)的體壁沒(méi)有黑色素形成,即在提供BH4的條件下,滅活PAH,阻止phe轉(zhuǎn)化成tyr,黑色素合成不能正常進(jìn)行,說(shuō)明phe是家蠶黑色素合成的重要前驅(qū)物,phe轉(zhuǎn)化成tyr是家蠶黑色素合成代謝的重要步驟;用HPLC檢測(cè)培養(yǎng)基中同時(shí)加入GTPCH抑制劑、TH抑制劑以及BH4培養(yǎng)的體壁中的tyr含量比培養(yǎng)基中同時(shí)加入GTPCH抑制劑和TH抑制劑培養(yǎng)的體壁中的tyr含量高,兩類培養(yǎng)都阻斷了tyr代謝消耗,都沒(méi)有黑色素形成,差異在于培養(yǎng)基中是否提供B

12、H4,提供BH4的tyr含量高,含量高說(shuō)明有tyr合成,因此tyr合成需要BH4,或者phe轉(zhuǎn)化成tyr需要BH4。(5)培養(yǎng)基中同時(shí)加入GTPCH抑制劑、PAH抑制劑和tyr培養(yǎng)的體壁沒(méi)有黑色素形成,培養(yǎng)基中同時(shí)加入GTPCH抑制劑、PAH抑制劑、tyr和BH4培養(yǎng)的體壁有黑色素形成,兩類培養(yǎng)都抑制了內(nèi)源性tyr合成而補(bǔ)充了外來(lái)tyr,差異在于是否提供BH4,提供BH4的有黑色素合成,因此,tyr衍生成黑色素需要BH4,或者tyr轉(zhuǎn)化