家蠶微孢子蟲核酸側(cè)向?qū)游鲈嚰垪l檢測(cè)方法的建立.pdf

1、家蠶微孢子蟲（Nosema bombycis）是一種家蠶常見的致病真菌，其引發(fā)的家蠶微粒子病是蠶桑產(chǎn)業(yè)中毀滅性的病害，因此家蠶微孢子蟲一直被各養(yǎng)蠶國(guó)家和地區(qū)列為法定的蠶業(yè)生產(chǎn)檢疫對(duì)象。為有效控制蠶業(yè)生產(chǎn)中因家蠶微孢子蟲引發(fā)的家蠶微粒子病，以免其引發(fā)家蠶死亡，如何在成品卵階段完成家蠶微孢子蟲的檢測(cè)成為蠶業(yè)科學(xué)研究中的重要工作之一。目前蠶業(yè)生產(chǎn)中常用的家蠶微孢子蟲檢測(cè)方法為母蛾鏡檢法，屬于間接檢查，其操作簡(jiǎn)單方便、結(jié)果直觀易懂，但由于其對(duì)檢

2、測(cè)人員要求很高，母蛾樣品準(zhǔn)備繁瑣，同時(shí)在鏡檢工作中容易將家蠶微孢子蟲與花粉粒、曲霉孢子等混淆，降低了檢測(cè)工作的速度和準(zhǔn)確度，因此建立直接檢測(cè)成品卵中家蠶微孢子蟲的方法已成為蠶業(yè)科學(xué)研究的重點(diǎn)。PCR技術(shù)是分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室的常用技術(shù)手段，因準(zhǔn)確、靈敏的優(yōu)勢(shì)成為了臨床及實(shí)驗(yàn)室病原微生物檢測(cè)的常用方法。免疫側(cè)向?qū)游鲈嚰垪l檢測(cè)法操作方便快捷，造價(jià)低廉，易在基層推廣，目前已在病原微生物或者臨床檢測(cè)的工作中占據(jù)了重要的地位。本研究旨在于聯(lián)合核酸擴(kuò)增

3、技術(shù)與免疫側(cè)向?qū)游鲈嚰垪l技術(shù)建立一種操作簡(jiǎn)單、特異性強(qiáng)、靈敏度高的核酸側(cè)向?qū)游鲈嚰垪l快速檢測(cè)方法，為成品卵中家蠶微粒子病的快速檢測(cè)做出貢獻(xiàn)。
　　1.家蠶微孢子蟲核酸側(cè)向?qū)游鲈嚰垪l檢測(cè)體系的建立
　　以家蠶微孢子蟲的LSU rRNA作為擴(kuò)增靶標(biāo)，依據(jù)其序列設(shè)計(jì)引物，而后以家蠶微孢子蟲基因組為模板通過(guò)PCR擴(kuò)增對(duì)引物進(jìn)行篩選，經(jīng)瓊脂糖核酸電泳選擇擴(kuò)增效率較高的引物對(duì)LSU323及LSU480作為候選引物，隨后對(duì)所選引物進(jìn)行修飾

4、，在上游引物5’端修飾生物素標(biāo)簽，下游引物5’端修飾羧基熒光素。隨后進(jìn)行無(wú)模板的PCR擴(kuò)增，并利用核酸側(cè)向?qū)游鲈嚰垪l對(duì)產(chǎn)物進(jìn)行檢測(cè)，最終選擇不形成可檢測(cè)異源二聚體的引物對(duì)LSU323進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)，其上游引物為：5’-Biotin-tctgtcacctccaatcaa-3’，下游引物為：5’-FAM-tatgttatttggtagttgtg-3’。通過(guò)對(duì)四種不同基因組提取方法的比較，最終確定可高效穩(wěn)定提取感染家蠶微粒子蠶卵基因組的NPT裂

5、解法作為后續(xù)實(shí)驗(yàn)的提取方法；隨后對(duì)不同DNA聚合酶進(jìn)行測(cè)試，最終選擇抗逆性較強(qiáng)，擴(kuò)增效果較好的Mighty Amp?DNA Polymerase為后續(xù)所用聚合酶，并對(duì)最佳擴(kuò)增條件進(jìn)行了確定。本檢測(cè)方法能把家蠶微孢子蟲與家蠶其他常見病原，如粘質(zhì)沙雷氏菌、家蠶核型多角體病毒、金黃色葡萄球菌、球孢白僵菌區(qū)分開來(lái)，且對(duì)于家蠶微孢子蟲DNA的檢測(cè)限度為10pg，對(duì)模擬家蠶微孢子蟲感染蠶卵的檢測(cè)限度為10spores/100粒蠶卵，此結(jié)果說(shuō)明本檢測(cè)

6、方法的特異性和靈敏度均能滿足蠶業(yè)生產(chǎn)的要求。與傳統(tǒng)的家蠶微孢子蟲分子生物學(xué)檢測(cè)方法相比，本檢測(cè)方法的DNA提取方法快捷高效，所得產(chǎn)物無(wú)需純化即能直接用于檢測(cè)，大大簡(jiǎn)化了樣品處理的步驟，從樣品準(zhǔn)備到得到最終結(jié)果總耗時(shí)約120 min。
　　2.家蠶微孢子蟲核酸側(cè)向?qū)游鰴z測(cè)試紙條的應(yīng)用
　　使用家蠶微孢子蟲核酸側(cè)向?qū)游鲈嚰垪l檢測(cè)帶毒母蛾及對(duì)應(yīng)的帶毒蠶卵、成品卵（原種及雜交一代種）、4株生產(chǎn)中分離的家蠶微孢子蟲分離株。檢測(cè)結(jié)果顯示

7、核酸側(cè)向?qū)游鲈嚰垪l能檢測(cè)帶毒母蛾及對(duì)應(yīng)的帶毒蠶卵。檢測(cè)的29個(gè)原種蠶卵樣品，其對(duì)應(yīng)母蛾鏡檢陽(yáng)性率100％，生產(chǎn)蟻蠶補(bǔ)正檢查陽(yáng)性率17%，用核酸側(cè)向?qū)游鲈嚰垪l檢測(cè)，其陽(yáng)性率為31%；檢測(cè)的67雜交一代種個(gè)樣品，其對(duì)應(yīng)的集團(tuán)母蛾鏡檢陽(yáng)性率100%，經(jīng)催青收蟻開展的補(bǔ)正檢查陽(yáng)性率49%，采用我們建立的核酸側(cè)向?qū)游鲈嚰垪l方法，其檢測(cè)陽(yáng)性率77%。通過(guò)對(duì)從生產(chǎn)中分離的4株家蠶微孢子蟲分離株的檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，可以檢測(cè)出其中3株?；诤怂醾?cè)層析試紙條檢測(cè)結(jié)

8、果可知該方法可以有效應(yīng)用于生產(chǎn)中家蠶微孢子蟲感染蠶卵的檢測(cè)，經(jīng)改良后也能用于感染母蛾的檢測(cè)。通過(guò)對(duì)核酸側(cè)向?qū)游鲈嚰垪l及瓊脂糖凝膠電泳的檢測(cè)結(jié)果的對(duì)比，可知核酸側(cè)向?qū)游鲈嚰垪l呈陽(yáng)性結(jié)果的樣品在使用瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)時(shí)同樣也顯示大小正確，條帶單一的陽(yáng)性結(jié)果，證明了核酸側(cè)向?qū)游鲈嚰垪l檢測(cè)方法的可靠性，重現(xiàn)性好。與傳統(tǒng)的母蛾鏡檢法相比，核酸側(cè)向?qū)游鲈嚰垪l檢測(cè)方法能夠直接用于蠶卵的檢測(cè)，其結(jié)果更加客觀公正，且本方法不依賴檢測(cè)人員的視力差異，也不受