水稻核黃素合酶基因克隆、表達(dá)、亞細(xì)胞定位和煙草硫氧還蛋白NtTRXh功能研究.pdf

1、核黃素在生物體內(nèi)形成黃素單核苷酸FMN和黃素腺嘌呤二核苷酸FAD，它們是黃素酶的輔酶。核黃素所形成的輔酶參與機(jī)體組織維生素C抗氧化作用的呼吸電子傳遞及氧化還原過(guò)程，參與植物抗氧化及過(guò)氧化過(guò)程，從而影響氧化性損傷及后續(xù)過(guò)敏反應(yīng)過(guò)程中活性氧中間體（ROIs）的產(chǎn)生，而ROIs是過(guò)敏細(xì)胞壞死的重要信號(hào)，能調(diào)節(jié)生長(zhǎng)、抗病、抗蟲(chóng)、抗逆，所以核黃素與植物免疫反應(yīng)有關(guān)。核黃素在植物和微生物中都能自我合成，合成途徑的倒數(shù)第二步是由2，4.二氧四氫喋啶合

2、酶（lumazinesynthase，LS）催化的，最后一步是由核黃素合酶（riboflavin synthase，Rs）催化的。在擬南芥中發(fā)現(xiàn)LS與茉莉酸途徑相交叉，與根對(duì)茉莉酸的敏感性，植物的抗病性密切相關(guān)。由此可推斷水稻上的OsLS和OsRS很可能存在著許多不為所知的功能，在植物上關(guān)于編碼這兩個(gè)酶的基因的報(bào)道不多，尤其是水稻的這兩個(gè)基因目前還沒(méi)有得到克隆。
　　 本實(shí)驗(yàn)從轉(zhuǎn)基因煙草中克隆到核黃素合成過(guò)程的最后一步關(guān)鍵酶的編

3、碼基因OsRS。OsRS列全長(zhǎng)1662 bp，與Gene ID OJ1111HO2.Predgene04的不含內(nèi)含子和非翻譯區(qū)的序列完全一致。原核表達(dá)OsRS蛋白質(zhì)，對(duì)表達(dá)的目的蛋白的可溶性進(jìn)行鑒定，發(fā)現(xiàn)OsRS基因表達(dá)產(chǎn)物在大腸桿菌中主要以不溶性包涵體形式存在，經(jīng)過(guò)超聲波破細(xì)菌，包涵體提取，洗滌處理后用，用6mol/1鹽酸胍變性溶解包涵體沉淀，能別得到包括His-tag在內(nèi)的66.37 kD大小的OsRS蛋白質(zhì)，分子大小與預(yù)期一致。我

4、們將溶解的包涵體OsRs蛋白表達(dá)、純化，通過(guò)免疫兔子制備了OsRs的多克隆抗體。利用免疫學(xué)的方法分析鑒定OsRS在煙草葉片上的亞細(xì)胞定位，再通過(guò)Western blot和免疫膠體金對(duì)OsRS的定位進(jìn)行分析.實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明OsRS定位于葉綠體中。
　　 硫氧還蛋白（thioredoxin，TRX）是一種小分子量蛋白質(zhì)，催化巰基-二硫鍵的交換反應(yīng)，參與細(xì)胞還原環(huán)境的調(diào)節(jié)，廣泛存在于植物的各種組織和器官內(nèi)，在新陳代謝中有重要作用，如消除

5、氧脅迫、參入蛋白質(zhì)的轉(zhuǎn)錄和翻譯。本研究從煙草中克隆了硫氧還蛋白基因NtTRXh，并推導(dǎo)出NtTRXh的氨基酸序列。構(gòu)建了高效表達(dá)載體，誘導(dǎo)表達(dá)重組菌得到分子大小為22.3kDa的融合蛋白，與推測(cè)的分子量一致。普通煙草中目前發(fā)現(xiàn)有三個(gè)h型TRX（Nicotiana tabacum thioredoxin h-like protein）基因（NtTRXh1，NtTRXh2，NtTRXh），其中的NtTRXh（AF435818）特異性的受到氧

6、脅迫劑百草枯（Paraquat）和病毒TMV的誘導(dǎo)表達(dá)，據(jù)此克隆了該基因，在大原核表達(dá)NtTRXh，并用金屬螯合層析（Ni柱）純化，用純化后的NtTRXh蛋白溶液125μg/ml注射煙草，煙草葉片中沒(méi)有過(guò)敏反應(yīng)現(xiàn)象，這說(shuō)明NtTRXh本身對(duì)植物的細(xì)胞沒(méi)有損害。根據(jù)TRX蛋白質(zhì)催化胰島素二硫鍵的性質(zhì)，測(cè)定了NtTRXh的催化活性。通過(guò)序列的同源性分析發(fā)現(xiàn)NtTRXh具有完整的TRX蛋白質(zhì)的活性位點(diǎn)WCGPC，屬于thioredoxin h