抑制水稻白葉枯病菌誘導煙草HR功能的克隆pA254的亞克隆研究.pdf

1、植物病原細菌在寄主植物上的過敏反應(HR)起始被認為是一種“抗病現(xiàn)象”受到廣泛關(guān)注,而病原細菌在非寄主植物上的HR癥狀也是判定一個細菌分離物是否具有植物致病性的重要指標。因為HR現(xiàn)象與植物病原菌的致病性及寄主和非寄主植物的抗病性有著重要的關(guān)系,因此研究植物病原細菌在寄主或非寄主上激發(fā)或抑制HR的機制對于闡釋植物細菌致病機理,植物病害抗病機理和病原細菌與寄主的互作關(guān)系具有十分重要的意義。
　　 本研究將前期從水稻白葉枯病菌(Xan

2、thomonas oryzae pv.oryzae,Xoo)PXO99A基因文庫中獲得的一個基因組克隆pA254重新導入水稻黃單胞菌PXO99A、RS105和OS198,驗證了其抑制這些病原菌野生菌株在煙草上激發(fā)過敏反應表型的功能。
　　 利用Tn5插入法構(gòu)建了pA254的突變體文庫,獲得了164個突變體,將其中34個突變的質(zhì)粒重新轉(zhuǎn)化PXO99A,測定轉(zhuǎn)化子在煙草上激發(fā)HR的能力。結(jié)果發(fā)現(xiàn),其中編號為1和4的兩個突變質(zhì)粒,使p

3、A254抑制HR的功能喪失。酶切發(fā)現(xiàn)這兩個克隆具有相同的條帶,證明插入位置可能是相同的。用Tn5上的引物測序,分析Tn5的插入部位,發(fā)現(xiàn)1,4號克隆上的Tn5轉(zhuǎn)座子插入在pA254上的谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶(GST)基因上。
　　 為進一步確定GST抑制煙草HR反應的功能,用PCR法克隆了GST的CDS序列。并將其克隆在可以轉(zhuǎn)化黃單胞菌的載體pHM1上,獲得pHM1-GST。將pHM1—GST轉(zhuǎn)化PXO99A,獲得轉(zhuǎn)化子PXO99A

4、/pHM1-GST,測定其激發(fā)煙草HR的能力,結(jié)果發(fā)現(xiàn),該轉(zhuǎn)化子不能在煙草上激發(fā)HR反應,這說明GS工具有和pA254一樣的抑制黃單胞菌在煙草上產(chǎn)生HR的功能。
　　 用overlap PCR法構(gòu)建了GST基因的基因缺失重組體,將其轉(zhuǎn)化PXO99A,獲得發(fā)生雙交換的突變體PXO△GST,測定該突變體在煙草上激發(fā)HR的能力,結(jié)果顯示,PXO99A基因組上GST基因的缺失不影響其在煙草上激發(fā)HR。再將pHM1-GST轉(zhuǎn)入GST缺失突