高毒力Bt菌株的篩選及cry2Ac10基因的克隆、表達和活性研究.pdf

1、蘇云金芽孢桿菌(Bacillus thuringiensis，Bt)是一種具有高度特異性，對環(huán)境友好的微生物殺蟲劑，其cry基因也是應用最為廣泛和最有潛力的抗蟲基因。本試驗從山東省土壤中分離Bt菌株，然后通過生物測定篩選對鱗翅目夜蛾科昆蟲具有高毒力的菌株，并對篩選出的高毒力菌株的蛋白組成和殺蟲蛋白基因型作相應的研究，在此基礎上，分離克隆新型的Bt的cry基因，研究該基因的表達和殺蟲活性。本試驗主要結果如下： 1.采用芽孢桿菌選擇

2、性培養(yǎng)基與晶體染色相結合的方法，從山東省采集的750份土樣中分離出Bt菌株57株，Bt菌株的平均分出率為7.6％。這些Bt菌株的晶體形態(tài)包括菱形、圓形等形狀。 2.以粘蟲和甜菜夜蛾初孵幼蟲為試蟲進行高毒力菌株的初篩，菌液濃度為6.0×10<'8>cfu/mL時，對粘蟲初孵幼蟲校正死亡率高于50％的菌株有QCL-1、QCY-3、QJN-1、WRC-1、WZ-1；對甜菜夜蛾初孵幼蟲校正死亡率高于50％的菌株有QCL-1、WRC-1、

3、HJY-1。對Bt菌株不同成分生物測定，試驗結果表明菌株QCL-1對幾種夜蛾科害蟲的毒力主要來自于芽孢和晶體混合物，菌株QCL-1對甜菜夜蛾初孵幼蟲的毒力顯著高于標準菌株HD-1，對粘蟲和粉紋夜蛾初孵幼蟲的毒力與標準菌株HD-1相當。 3.SDS-PAGE分析菌株QCL-1殺蟲晶體蛋白主要為130kDa和70kDa兩種，利用cry基因的PCR-RFLP方法鑒定菌株QCL-1中含有cry1Cb、cry1Fa、cry1Fb、cry2

4、Ab和未知的cry2A類基因。 4.以菌株QCL-1質(zhì)粒為模板，利用設計的cry2A類特異性引物FY2A5和FY2A3，PCR擴增出1.9kb的目的片段，將其克隆到表達載體pET-21b(+)，構建了T7啟動子控制的大腸桿菌重組表達質(zhì)粒pET21b-cry2Ac。序列分析表明，該基因的編碼框由1872個堿基組成，該基因編碼的蛋白質(zhì)由623個氨基酸組成，其中親水性氨基酸占38.35％，疏水性氨基酸占45.26％，酸性氨基酸占6.9

5、0％，堿性氨基酸占9.48％。蛋白質(zhì)的分子量為69.7kDa，等電點為8.825，為弱堿性蛋白質(zhì)。該基因編碼的氨基酸序列與已公布的Cry2Ac蛋白的氨基酸序列均不同，氨基酸序列同源性在97.4％～99.7％之間。該基因的核苷酸序列已經(jīng)在GenBank登錄(GenBank accession EF405952)，并被Bt基因國際命名委員會確認為一個新的cry2Ac基因，正式命名為cry2Ac10。 5.將重組表達質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌B