高碳酸酐酶活性油菜的篩選及其基因克隆與異源表達(dá).pdf

1、西南巖溶地區(qū)特殊的雙層水文地質(zhì)結(jié)構(gòu)，決定了西南巖溶生態(tài)系統(tǒng)的脆弱性。
　　 因此，西南巖溶地區(qū)的植被恢復(fù)和生態(tài)重建比較緩慢。大量研究表明，西南巖溶地區(qū)適生植物的碳酸酐酶活性很高。所以，研究具有高碳酸酐酶活性的經(jīng)濟(jì)作物對解決西南巖溶地區(qū)的生態(tài)恢復(fù)和改善當(dāng)?shù)氐慕?jīng)濟(jì)現(xiàn)狀具有重要意義。
　　 碳酸酐酶（Carbonic Anhydrase, CA; EC 4.2.1.1）是一種催化CO2和HCO3-之間相互轉(zhuǎn)化的含鋅金屬酶，是一

2、種與光合作用密切相關(guān)的酶，近年來研究表明它與環(huán)境逆境之間存在一定的應(yīng)答關(guān)系。高CA 活性油菜的篩選及其基因克隆，不僅對于提高非巖溶地區(qū)油菜的產(chǎn)量和抗逆性具有重要意義，而且可為解決西南巖溶地區(qū)油菜及其他經(jīng)濟(jì)作物的抗旱性等適應(yīng)性問題并提高其產(chǎn)量奠定基礎(chǔ)。為此，我們進(jìn)行了如下研究：一、跟蹤監(jiān)測了不同品種油菜的不同部位在不同發(fā)育時(shí)期的CA 生理活性，并重點(diǎn)研究了油菜CA 活性與鋅含量、光合作用之間的關(guān)系；二、選定抽薹期高CA 活性的油菜為實(shí)驗(yàn)對

3、象，研究油菜葉片噴灑外源鋅離子進(jìn)一步提高CA 活性對提高油菜產(chǎn)量和抗旱性的作用；三、以高CA 活性的油菜為材料，進(jìn)行了油菜CA基因的克隆、分析及異源表達(dá)。本文取得的主要結(jié)論如下：
　　 1.CA 活性在不同品種油菜中的大小順序?yàn)椋焊仕{(lán)型油菜＞白菜型油菜＞蕪菁＞埃塞俄比亞芥。CA在油菜的不同部位均有分布：其中葉片中的CA 活性最大，莖中的次之，根中的最小。葉片中CA 活性在油菜不同發(fā)育時(shí)期的變化趨勢是先上升后下降，在抽薹期達(dá)到最大

4、。研究了油菜整個生育期的葉片CA 活性、凈光合速率和鋅元素含量之間的相關(guān)關(guān)系。結(jié)果表明：CA 活性與凈光合速率的變化之間相關(guān)性系數(shù)為0.99；CA 活性與鋅元素含量的變化之間相關(guān)性系數(shù)為0.95。
　　 2.以抽薹期高CA活性的油菜為材料，研究了葉面噴鋅對大田種植的抽薹期油菜光合作用和CA活性的影響。結(jié)果顯示，葉面噴鋅可以提高油菜的凈光合速率和CA活性，有助于提高油菜的產(chǎn)量；同時(shí)，葉面噴鋅降低了油菜的蒸騰速率和氣孔導(dǎo)度，可以提高

5、油菜的抗旱性。為進(jìn)一步驗(yàn)證CA活性與油菜抗旱性正相關(guān)的關(guān)系，研究了盆栽條件下葉面噴鋅對抽薹期油菜的CA活性和抗旱性的影響。結(jié)果顯示，葉面噴鋅后，油菜在干旱誘導(dǎo)過程中CA活性、凈光合速率和脯氨酸含量高于未噴鋅油菜，而丙二醛含量低于未噴鋅油菜，這些說明葉面噴鋅使油菜抗旱性增加。因?yàn)槿~面噴鋅后油菜的CA活性增加，所以油菜的抗旱性提高。綜上，兩個噴鋅實(shí)驗(yàn)結(jié)果說明：高CA活性的油菜具有產(chǎn)量高和抗旱性強(qiáng)的特點(diǎn)。
　　 3.以篩選出的高CA

6、活性的油菜為實(shí)驗(yàn)材料，在十字花科幾種植物β-CA基因的高度保守區(qū)設(shè)計(jì)一對引物，通過PCR 擴(kuò)增獲得了一個996 bp的CA基因片段，然后采用RACE 技術(shù)首次從甘藍(lán)型油菜中克隆了CA基因全長。甘藍(lán)型油菜CA基因的cDNA 全長1190bp，編碼區(qū)在48～ 1043 之間，推導(dǎo)編碼331個氨基酸。5′非翻譯區(qū)長度為47 bp，3′非翻譯區(qū)長度為118 bp。通過同源性分析發(fā)現(xiàn)，該基因編碼的蛋白質(zhì)與擬南芥β-CA 同源性達(dá)到94％，證明我們

7、克隆到的是β-CA基因，該基因被命名為BnCA1，GenBank 登錄號為GQ356780。
　　 4.利用大腸桿菌體外表達(dá)技術(shù)，將甘藍(lán)型油菜β-CA基因構(gòu)建到原核表達(dá)載體pET-32a(+)中，并將得到的重組質(zhì)粒pET32-CA 導(dǎo)入E. coli BL21(DE3)中，通過對誘導(dǎo)溫度和IPTG濃度等條件的摸索，在28 ℃加入終濃度為1mM IPTG 實(shí)現(xiàn)了甘藍(lán)型油菜β-CA基因在大腸桿菌中的高效表達(dá)。SDS-PAGE 電泳顯

8、示，在37.5 kDa 位置出現(xiàn)目的條帶，分子量大小與我們預(yù)期的一致。
　　 5. 利用PSORT、PSIPRED、Swiss-Model和NCBI-VAST等在線服務(wù)器對甘藍(lán)型油菜β-CA的一級結(jié)構(gòu)、二級結(jié)構(gòu)、三級結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析。亞細(xì)胞定位預(yù)測的結(jié)果顯示，甘藍(lán)型油菜β-CA 定位于葉綠體基質(zhì)；PSIPRED 預(yù)測的二級結(jié)構(gòu)顯示，甘藍(lán)型油菜β-CA 含45.9％的α螺旋，37.7％的隨機(jī)卷曲和16.4％的β折疊；利用同源建模法構(gòu)建