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1、本研究以從魚(yú)尾葵上分離的PP61菌株上尋找新的cry基因表達(dá)的Cry蛋白對(duì)柑橘風(fēng)蝶有效活性為目的,對(duì)Bt PP61菌株進(jìn)行一系列的生理生化分析,推測(cè)PP61可能屬庫(kù)斯塔克亞種。采用PCR-RFLP技術(shù)對(duì)PP61菌株所含cry基因進(jìn)行分析,含有編碼ICP的cry1Ba、cry1Cb、cry1Ib和cry2Ab等基因。自1995年Shin等克隆cry1Ib1基因后,并未有后續(xù)研究報(bào)道。因此,本研究從Bt PP61中克隆得到的cry1Ib基因
2、全長(zhǎng)2160 bp,編碼719Aa的蛋白,該蛋白分子量和等電點(diǎn)通過(guò)軟件預(yù)測(cè)分別為81.39 kDa和6.425。cry1Ib已在GenBank上登錄,登錄號(hào)為EU233027,并被Bt δ-內(nèi)毒素國(guó)際基因命名委員會(huì)正式命名為cry1Ib2。在線BLAST軟件分析表明推導(dǎo)的Cry1Ib2與已報(bào)道的Cry1I蛋白具有很高的氨基酸序列同源性。信號(hào)肽分析說(shuō)明Cry1Ib蛋白的前端沒(méi)有信號(hào)肽,它是一種胞內(nèi)蛋白。用在線Conserved Domai
3、n Search工具進(jìn)行保守功能區(qū)分析,推導(dǎo)出Cry1Ib2蛋白質(zhì)一級(jí)結(jié)構(gòu)功能域主要包含有:位于毒素分子N端的結(jié)構(gòu)域Ⅰ、位于C端的結(jié)構(gòu)域Ⅲ及位于結(jié)構(gòu)域Ⅰ和結(jié)構(gòu)域Ⅲ之間的結(jié)構(gòu)域Ⅱ,其中N端結(jié)構(gòu)域參與了細(xì)胞膜的穿孔與芽孢的形成,后兩者則參與了與膜受體蛋白的識(shí)別和結(jié)合。對(duì)Cry1Ib2的二級(jí)和三級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測(cè),結(jié)果顯示在蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)中,25%為α-螺旋,28%為β-片層,18%為β-轉(zhuǎn)角,29%為無(wú)規(guī)則線圈。 通過(guò)將cry1Ib2與
4、pET29a(+)表達(dá)載體連接,構(gòu)建了重組表達(dá)載體pEt29a-cry1Ib2,并成功轉(zhuǎn)入大腸桿菌E.coli BL21(DE3)。陽(yáng)性克隆子通過(guò)PCR和核酸測(cè)序得以驗(yàn)證。cry1Ib2經(jīng)IPTG誘導(dǎo)大量表達(dá)。SDS-PAGE分析說(shuō)明表達(dá)的融合蛋白(包含(His)6 tag)為81 kDa左右,與ExPASy軟件預(yù)測(cè)的基本一致。蛋白可溶性試驗(yàn)說(shuō)明該表達(dá)產(chǎn)物部分可溶。生物測(cè)定表明表達(dá)產(chǎn)物對(duì)5齡柑橘鳳蝶幼蟲(chóng)具有殺蟲(chóng)活性,并且對(duì)其生長(zhǎng)也表現(xiàn)出
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