Bt基因與GNA基因融合基因的構(gòu)建、表達(dá)及其生物活性研究.pdf

1、水稻在生長(zhǎng)過程中受到多種害蟲的危害，蘇云金芽孢桿菌（Bacillus thuringiensis，Bt）是目前應(yīng)用最多的殺蟲微生物。自從1987年報(bào)道第一例轉(zhuǎn)基因作物以來，已經(jīng)有很多水稻品系轉(zhuǎn)入了各種Bt cry基因，并能對(duì)鱗翅目害蟲表現(xiàn)出抗性。但尚沒有發(fā)現(xiàn)一種Bt基因?qū)λ就崮恐匾οx如褐飛虱（Nilaparvata lugens）等有殺蟲活性。同時(shí)，害蟲可能會(huì)對(duì)Bt產(chǎn)生抗性。盡管還沒有在大田實(shí)驗(yàn)中害蟲表現(xiàn)對(duì)轉(zhuǎn)Bt水稻抗性的報(bào)道，但

2、在室內(nèi)實(shí)驗(yàn)中，已經(jīng)有害蟲表現(xiàn)出了對(duì)Cry蛋白的抗性。構(gòu)建抗蟲融合基因會(huì)是一種新的有效的方法用以解決這些問題。
　　 雪花蓮?fù)庠茨兀℅alanthus nivalis agglutinin，GNA）是一種甘露糖專一識(shí)別的植物凝集素。研究表明人工喂食GNA和轉(zhuǎn)GNA作物都對(duì)飛虱表現(xiàn)出一定的毒力。所以，GNA為可以作為一個(gè)很好的候選基因用以和Bt構(gòu)成融合基因。為此，本研究將Bt殺蟲蛋白CrylAc結(jié)構(gòu)域Ⅰ部分基因序列與成熟GNA蛋

3、白基因序列進(jìn)行融合，以期使其表達(dá)一種對(duì)鱗翅目和同翅目害蟲均具有良好抗蟲活性的新的殺蟲蛋白。獲得的主要研究結(jié)果如下：
　　 1．首先分別單獨(dú)克隆出CrylAc結(jié)構(gòu)域Ⅰ部分基因序列與成熟GNA蛋白基因序列，再連接到克隆載體pCR2.1上，構(gòu)建融合基因（CrylAc/GNA）。將融合基因克隆到原核表達(dá)載體pET11a上，即pET11a-CrylAc-GNA，再轉(zhuǎn)化大腸桿菌（Escherichia coli，E．coli）。結(jié)果顯示能夠

4、表達(dá)得到含有GNA成熟蛋白結(jié)構(gòu)和CrylAc蛋白結(jié)構(gòu)域Ⅰ的融合蛋白。經(jīng)凝血活性測(cè)定表明該融合蛋白具有凝血活性。另外，生物測(cè)定實(shí)驗(yàn)也表明融合蛋白對(duì)褐飛虱仍保持有GNA蛋白應(yīng)具有的殺蟲活性。
　　 2．設(shè)計(jì)引物從含有融合基因的pET11a載體上分別PCR擴(kuò)增出融合基因、單獨(dú)的CrylAc基因和單獨(dú)的GNA基因，再連接到T載體上，轉(zhuǎn)化大腸桿菌E．coli。經(jīng)過檢驗(yàn)測(cè)定后，將三個(gè)基因分別克隆到植物表達(dá)載體pCAMBIA1300s上，即構(gòu)