ChIFN-γ基因的植物表達(dá)及其生物活性研究.pdf

1、干擾素(IFN)作為一種動(dòng)物細(xì)胞產(chǎn)生的細(xì)胞因子，具有廣譜抗病毒活性和免疫保護(hù)作用。隨著養(yǎng)雞業(yè)集約化和商品化方向的發(fā)展，對(duì)病毒性疾病的有效預(yù)防與治療，需要大量的干擾素。目前，IFN的生產(chǎn)主要以原核表達(dá)系統(tǒng)為主，后處理工藝繁瑣，導(dǎo)致IFN活性低，生產(chǎn)成本高。而應(yīng)用植物生物反應(yīng)器生產(chǎn)IFN可以克服上述缺點(diǎn)，同時(shí)具有生產(chǎn)量大、可作為植物疫苗佐劑直接口服等優(yōu)勢(shì)。因此，研究IFN在植物中的表達(dá)特性及其生物學(xué)活性具有重要的理論價(jià)值和實(shí)踐意義。

2、　　研究利用GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)登錄的ChIFN-γ基因序列，依據(jù)油菜密碼子最高使用頻率優(yōu)化并設(shè)計(jì)了ChIFN-γ基因，人工合成長(zhǎng)度614bp，包含有油菜Napin信號(hào)肽序列、Kozak序列和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)滯留信號(hào)肽SEKDEL序列的ChIFN-γ融合基因。
　　采用特異性引物，PCR擴(kuò)增得到1158bp的Napin油菜種子特異性啟動(dòng)子。分析表明，Napin啟動(dòng)子中含有啟動(dòng)子基本元件及特異性元件ABREs和RY基序。應(yīng)用同尾酶連接法構(gòu)建了

3、pSH-NGN、pSH-NGNL、pSH-IFNG植物表達(dá)載體用于遺傳轉(zhuǎn)化煙草和油菜。
　　為了驗(yàn)證植物表達(dá)載體設(shè)計(jì)與構(gòu)建是否正確，將含有質(zhì)粒pSH-NGN、pSH-NGNL和pSH-IFNG的根癌農(nóng)桿菌，以生菜為受體材料，采用真空滲透法進(jìn)行瞬時(shí)表達(dá)研究。結(jié)果表明，三種植物表達(dá)載體在生菜中瞬時(shí)表達(dá)ChIFN-γ蛋白的平均含量分別為675.7pg/g、665.7pg/g及519.5pg/g。為簡(jiǎn)化蛋白提取方法，降低目的蛋白降解速度，

4、采用不同的蛋白緩沖液提取ChIFN-γ蛋白。ELISA檢測(cè)結(jié)果顯示，以組成為50mMPBS,pH7.5、1％SDS、0.25MNaCl、1％β-巰基乙醇和0.05％Tween-20的緩沖液提取目的蛋白的效率最高，每克葉片最高達(dá)到1.2μg。Western blot檢測(cè)表明，表達(dá)的蛋白分子量大小約30kDa。
　　將含有質(zhì)粒pSH-IFNG和pSH-NGNL的根癌農(nóng)桿菌EHA105遺傳轉(zhuǎn)化煙草，獲得24株轉(zhuǎn)ChIFN-γ基因煙草。經(jīng)

5、PCR、RT-PCR、GUS組織化學(xué)染色和ELISA檢測(cè)表明，ChIFN-γ基因已整合到煙草的染色體中，并能正確轉(zhuǎn)錄與表達(dá)。ChIFN-γ蛋白在轉(zhuǎn)基因煙草植株中的表達(dá)量最高達(dá)到20μg/g，高出已報(bào)道的轉(zhuǎn)基因煙草表達(dá)外源基因的通常水平（0.000017％-0.001％）。經(jīng)Western blot檢測(cè)，目的蛋白為30kDa和40kDa，分析為糖基化程度不同所致。對(duì)轉(zhuǎn)基因煙草T0代完整生長(zhǎng)期的農(nóng)藝性狀觀察發(fā)現(xiàn)，除蟲(chóng)害較少、葉片粘性增加、花

6、苞較小、種子籽粒數(shù)少及色澤稍淺外，其它性狀與野生型差異不顯著。
　　將質(zhì)粒pSH-IFNG、pSH-NGNL以根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)法遺傳轉(zhuǎn)化油菜，篩選出25株轉(zhuǎn)ChIFN-γ油菜。其中Napin啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)表達(dá)的ChIFN-γ蛋白最高表達(dá)量達(dá)到58μg/g，比35S啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的轉(zhuǎn)化植株總體平均高出2.64倍，最高達(dá)5.17倍。表明在油菜中由Napin啟動(dòng)子及其信號(hào)肽組成的ChIFN-γ基因的表達(dá)盒，ChIFN-γ蛋白表達(dá)量明顯高于組成型啟

7、動(dòng)子35S。Napin啟動(dòng)子的‘滲漏’現(xiàn)象與其含有啟動(dòng)子元件有關(guān)。
　　以轉(zhuǎn)ChIFN-γ基因煙草T0代葉片粗提總蛋白進(jìn)行雞胚成纖維細(xì)胞病變?cè)囼?yàn)確定ChIFN-γ的活性效價(jià)。雞胚成纖維細(xì)胞培養(yǎng)約24h呈單層時(shí)，采用VSV（TCID50=10-5）病毒攻毒，在22h和42h時(shí)分別觀察細(xì)胞形態(tài)，計(jì)算得到每毫克轉(zhuǎn)基因煙草中ChIFN-γ蛋白效價(jià)為5.12×103U。
　　機(jī)械摩擦法接種易感型TMV病毒，6天內(nèi)，轉(zhuǎn)基因煙草組對(duì)病毒抑

8、制率為100％，隨著時(shí)間延長(zhǎng)抑制率平緩下降，16天后抑制率穩(wěn)定在約32％，接毒植株的生長(zhǎng)并未表現(xiàn)出受到抑制的現(xiàn)象。對(duì)照組一周后開(kāi)始出現(xiàn)不同程度的花葉和枯斑，感染率達(dá)到95％。說(shuō)明轉(zhuǎn)ChIFN-γ基因煙草植株對(duì)TMV的浸染具有顯著抑制作用。
　　采用漂浮板快速育苗，獲取大量的轉(zhuǎn)基因植株葉片。將轉(zhuǎn)基因煙草葉片勻漿后添加至飼料中，以每克飼料添加50U ChIFN-γ蛋白和每只雞20g飼料/天的喂養(yǎng)量，分組隔離喂養(yǎng)1-10天后，采用NDV

9、強(qiáng)毒株病毒進(jìn)行攻毒，20天后捕殺。結(jié)果顯示，ChIFN-γ蛋白具有增加雛雞體重的作用；血清凝集試驗(yàn)顯示，飼喂ChIFN-γ蛋白組NDV抗體效價(jià)高于對(duì)照組；喂食300U ChIFN-γ蛋白對(duì)雛雞的保護(hù)率可達(dá)80％。表明ChIFN-γ蛋白可通過(guò)口服喂養(yǎng)途徑顯著地提高雞體抗病毒能力。
　　自然接種煙草蚜蟲(chóng)和離體利用轉(zhuǎn)基因煙葉飼喂野生斜紋夜蛾幼蟲(chóng)及煙青蟲(chóng)，轉(zhuǎn)ChIFN-γ基因煙葉表現(xiàn)出顯著的抗蟲(chóng)效果。通過(guò)測(cè)定煙草煙堿含量、飼喂煙葉后煙青蟲(chóng)

10、蛋白酶活性變化、煙草中揮發(fā)性物質(zhì)和對(duì)煙草組織進(jìn)行切片染色觀察。發(fā)現(xiàn)煙堿含量與對(duì)照無(wú)顯著差異；12h時(shí)，飼喂轉(zhuǎn)基因煙草組的蟲(chóng)體蛋白酶活性較對(duì)照組低5.4％；轉(zhuǎn)基因煙草葉片增厚，細(xì)胞致密，細(xì)胞壁增厚，表皮腺毛數(shù)量增加可能是導(dǎo)致其抗蟲(chóng)的直接因素之一；轉(zhuǎn)基因組與野生型煙草揮發(fā)性成分存在一定的差異，轉(zhuǎn)基因煙草中黑松三烯和西柏三烯二醇含量的提高與其抗蟲(chóng)性直接相關(guān)，ChIFN-γ基因激活的多種轉(zhuǎn)錄因子可能結(jié)合了腺毛發(fā)育相關(guān)基因的cis調(diào)節(jié)元件，上調(diào)了