ChIFN-γ基因的植物表達及其生物活性研究.pdf

1、干擾素(IFN)作為一種動物細胞產(chǎn)生的細胞因子，具有廣譜抗病毒活性和免疫保護作用。隨著養(yǎng)雞業(yè)集約化和商品化方向的發(fā)展，對病毒性疾病的有效預(yù)防與治療，需要大量的干擾素。目前，IFN的生產(chǎn)主要以原核表達系統(tǒng)為主，后處理工藝繁瑣，導(dǎo)致IFN活性低，生產(chǎn)成本高。而應(yīng)用植物生物反應(yīng)器生產(chǎn)IFN可以克服上述缺點，同時具有生產(chǎn)量大、可作為植物疫苗佐劑直接口服等優(yōu)勢。因此，研究IFN在植物中的表達特性及其生物學(xué)活性具有重要的理論價值和實踐意義。

2、　　研究利用GenBank數(shù)據(jù)庫登錄的ChIFN-γ基因序列，依據(jù)油菜密碼子最高使用頻率優(yōu)化并設(shè)計了ChIFN-γ基因，人工合成長度614bp，包含有油菜Napin信號肽序列、Kozak序列和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)滯留信號肽SEKDEL序列的ChIFN-γ融合基因。
　　采用特異性引物，PCR擴增得到1158bp的Napin油菜種子特異性啟動子。分析表明，Napin啟動子中含有啟動子基本元件及特異性元件ABREs和RY基序。應(yīng)用同尾酶連接法構(gòu)建了

3、pSH-NGN、pSH-NGNL、pSH-IFNG植物表達載體用于遺傳轉(zhuǎn)化煙草和油菜。
　　為了驗證植物表達載體設(shè)計與構(gòu)建是否正確，將含有質(zhì)粒pSH-NGN、pSH-NGNL和pSH-IFNG的根癌農(nóng)桿菌，以生菜為受體材料，采用真空滲透法進行瞬時表達研究。結(jié)果表明，三種植物表達載體在生菜中瞬時表達ChIFN-γ蛋白的平均含量分別為675.7pg/g、665.7pg/g及519.5pg/g。為簡化蛋白提取方法，降低目的蛋白降解速度，

4、采用不同的蛋白緩沖液提取ChIFN-γ蛋白。ELISA檢測結(jié)果顯示，以組成為50mMPBS,pH7.5、1％SDS、0.25MNaCl、1％β-巰基乙醇和0.05％Tween-20的緩沖液提取目的蛋白的效率最高，每克葉片最高達到1.2μg。Western blot檢測表明，表達的蛋白分子量大小約30kDa。
　　將含有質(zhì)粒pSH-IFNG和pSH-NGNL的根癌農(nóng)桿菌EHA105遺傳轉(zhuǎn)化煙草，獲得24株轉(zhuǎn)ChIFN-γ基因煙草。經(jīng)

5、PCR、RT-PCR、GUS組織化學(xué)染色和ELISA檢測表明，ChIFN-γ基因已整合到煙草的染色體中，并能正確轉(zhuǎn)錄與表達。ChIFN-γ蛋白在轉(zhuǎn)基因煙草植株中的表達量最高達到20μg/g，高出已報道的轉(zhuǎn)基因煙草表達外源基因的通常水平（0.000017％-0.001％）。經(jīng)Western blot檢測，目的蛋白為30kDa和40kDa，分析為糖基化程度不同所致。對轉(zhuǎn)基因煙草T0代完整生長期的農(nóng)藝性狀觀察發(fā)現(xiàn)，除蟲害較少、葉片粘性增加、花

6、苞較小、種子籽粒數(shù)少及色澤稍淺外，其它性狀與野生型差異不顯著。
　　將質(zhì)粒pSH-IFNG、pSH-NGNL以根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)法遺傳轉(zhuǎn)化油菜，篩選出25株轉(zhuǎn)ChIFN-γ油菜。其中Napin啟動子驅(qū)動表達的ChIFN-γ蛋白最高表達量達到58μg/g，比35S啟動子驅(qū)動的轉(zhuǎn)化植株總體平均高出2.64倍，最高達5.17倍。表明在油菜中由Napin啟動子及其信號肽組成的ChIFN-γ基因的表達盒，ChIFN-γ蛋白表達量明顯高于組成型啟

7、動子35S。Napin啟動子的‘滲漏’現(xiàn)象與其含有啟動子元件有關(guān)。
　　以轉(zhuǎn)ChIFN-γ基因煙草T0代葉片粗提總蛋白進行雞胚成纖維細胞病變試驗確定ChIFN-γ的活性效價。雞胚成纖維細胞培養(yǎng)約24h呈單層時，采用VSV（TCID50=10-5）病毒攻毒，在22h和42h時分別觀察細胞形態(tài)，計算得到每毫克轉(zhuǎn)基因煙草中ChIFN-γ蛋白效價為5.12×103U。
　　機械摩擦法接種易感型TMV病毒，6天內(nèi)，轉(zhuǎn)基因煙草組對病毒抑

8、制率為100％，隨著時間延長抑制率平緩下降，16天后抑制率穩(wěn)定在約32％，接毒植株的生長并未表現(xiàn)出受到抑制的現(xiàn)象。對照組一周后開始出現(xiàn)不同程度的花葉和枯斑，感染率達到95％。說明轉(zhuǎn)ChIFN-γ基因煙草植株對TMV的浸染具有顯著抑制作用。
　　采用漂浮板快速育苗，獲取大量的轉(zhuǎn)基因植株葉片。將轉(zhuǎn)基因煙草葉片勻漿后添加至飼料中，以每克飼料添加50U ChIFN-γ蛋白和每只雞20g飼料/天的喂養(yǎng)量，分組隔離喂養(yǎng)1-10天后，采用NDV

9、強毒株病毒進行攻毒，20天后捕殺。結(jié)果顯示，ChIFN-γ蛋白具有增加雛雞體重的作用；血清凝集試驗顯示，飼喂ChIFN-γ蛋白組NDV抗體效價高于對照組；喂食300U ChIFN-γ蛋白對雛雞的保護率可達80％。表明ChIFN-γ蛋白可通過口服喂養(yǎng)途徑顯著地提高雞體抗病毒能力。
　　自然接種煙草蚜蟲和離體利用轉(zhuǎn)基因煙葉飼喂野生斜紋夜蛾幼蟲及煙青蟲，轉(zhuǎn)ChIFN-γ基因煙葉表現(xiàn)出顯著的抗蟲效果。通過測定煙草煙堿含量、飼喂煙葉后煙青蟲

10、蛋白酶活性變化、煙草中揮發(fā)性物質(zhì)和對煙草組織進行切片染色觀察。發(fā)現(xiàn)煙堿含量與對照無顯著差異；12h時，飼喂轉(zhuǎn)基因煙草組的蟲體蛋白酶活性較對照組低5.4％；轉(zhuǎn)基因煙草葉片增厚，細胞致密，細胞壁增厚，表皮腺毛數(shù)量增加可能是導(dǎo)致其抗蟲的直接因素之一；轉(zhuǎn)基因組與野生型煙草揮發(fā)性成分存在一定的差異，轉(zhuǎn)基因煙草中黑松三烯和西柏三烯二醇含量的提高與其抗蟲性直接相關(guān)，ChIFN-γ基因激活的多種轉(zhuǎn)錄因子可能結(jié)合了腺毛發(fā)育相關(guān)基因的cis調(diào)節(jié)元件，上調(diào)了