Cecrop-m2A10融合基因的構(gòu)建、原核表達(dá)、生物學(xué)活性分析及轉(zhuǎn)基因體系的構(gòu)建.pdf

1、研究背景：蚊媒可傳播多種疾病，如：瘧疾(malaria)、流行性乙型腦炎(epidemicencepha]itisB)、絲蟲病(filariasis)、登革熱(denguefever)等，是嚴(yán)重威脅人民生命健康的重要疾病。一些蚊媒病如登革熱的發(fā)病率呈逐年遞增的趨勢并常有局部暴發(fā)流行。瘧疾是世界上感染率最高，死亡人數(shù)最多的疾病之一。每年有超過30億人受到瘧疾的威脅，死亡人數(shù)達(dá)200余萬。造成這種嚴(yán)重局面的最主要原因是缺乏預(yù)防瘧疾的有效措施

2、以及蚊媒和病原不斷產(chǎn)生耐藥性。因此探索并開發(fā)新的防治蚊媒疾病的措施已成為當(dāng)前迫切需要解決的問題，控制昆蟲媒介再次成為最有效且實(shí)用的抗瘧手段。 瘧原蟲是人體瘧疾的病原體，共有四種類型，在我國主要是間日瘧原蟲和惡性瘧原蟲。人體瘧原蟲需要人和雌性按蚊做宿主，它在蚊體內(nèi)的發(fā)育包括在蚊胃腔內(nèi)進(jìn)行有性生殖即配子生殖(gametogony)和在蚊胃壁進(jìn)行的無性生殖即孢子增殖(sporogony)兩個(gè)階段。子孢子是瘧原蟲感染人體的階段。惡性瘧原

3、蟲環(huán)子孢子蛋白(Ciroumsporozoiteprotein，CSP)覆蓋于子孢子表面，是其重要保護(hù)性抗原及粘附入侵靶細(xì)胞的物質(zhì)基礎(chǔ)。惡性瘧CSP的鼠源單克隆抗體2A10在體外能夠阻止子孢子進(jìn)入蚊唾液腺和人肝細(xì)胞。2A10scFv(single-chainFvantibodyfragment)是2A10單鏈抗體可變區(qū)片段。在以鼠源性2A10scFv為靶基因的轉(zhuǎn)基因蚊中，蚊體內(nèi)所表達(dá)的2A10scFv能夠與子孢子結(jié)合，從而阻斷其鉆入唾液

4、腺。但由于蛋白的表達(dá)量不高，因此未能達(dá)到完全阻斷子孢子入侵的效果。 近年來，國際上提出了利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)對蚊媒進(jìn)行遺傳修飾以控制蚊媒疾病的新策略。外源基因在轉(zhuǎn)基因蚊體內(nèi)的表達(dá)對于轉(zhuǎn)基因蚊的抗病原效應(yīng)至關(guān)重要，它受到啟動(dòng)子、插入部位及外源基因本身特性等諸多因素的影響。其中，外源基因的密碼子在宿主蚊體內(nèi)的使用頻率，即遺傳密碼子的偏嗜性被認(rèn)為是一個(gè)重要影響因素。物種間編碼同一氨基酸的不同密碼子的使用頻率存在差別，一些在外源基因中出現(xiàn)的密

5、碼子很少為表達(dá)宿主所使用，相對應(yīng)的tRNA在宿主體內(nèi)稀少，由此影響了外源基因mRNA的翻譯過程，從而降低了效應(yīng)蛋白的表達(dá)量。在對于大腸桿菌偏嗜性人胰島素樣生長因子1的研究中，實(shí)驗(yàn)人員依據(jù)大腸桿菌遺傳密碼子使用頻率表，人工合成3條DNA單鏈，PCR拼接擴(kuò)增出適于在大腸桿菌中表達(dá)的人IGF-1基因。所構(gòu)建的大腸桿菌偏嗜性人IGF-1基因可顯著提高rhIGF=1的產(chǎn)率。此外將異源的免疫原基因密碼子優(yōu)化為免疫接種動(dòng)物偏嗜性密碼子能夠提高抗原表達(dá)

6、效率并改進(jìn)DNA疫苗免疫效果也己被許多研究所證實(shí)。本實(shí)驗(yàn)中經(jīng)對比分析，鼠源性2A10scFv基因中有些密碼子在蚊體內(nèi)的使用頻率確實(shí)很低，例如，編碼絲氨酸的密碼子UCU在岡比亞按蚊的使用頻率僅為4.1‰。那么我們能否通過2A10scFv基因密碼子的蚊偏嗜性改造，使其更適于在轉(zhuǎn)基因蚊體內(nèi)表達(dá)從而提高其表達(dá)量、增加其穩(wěn)定性及生物學(xué)活性呢? 抗菌肽(antimicrobialpeptides，AMP)是抗菌活性短肽的總稱。目前已發(fā)現(xiàn)抗菌

7、肽或類似的小分子肽類廣泛存在于生物界，包括細(xì)菌、動(dòng)植物和人類。內(nèi)源性的抗菌肽經(jīng)誘導(dǎo)合成，在機(jī)體抵抗病原的入侵方面起著重要的作用，被認(rèn)為是缺乏特異性免疫功能生物的重要防御成分?？咕木哂袕V譜殺菌作用，大多數(shù)對革蘭氏陽性菌有較強(qiáng)的殺滅作用，有些則對革蘭氏陰性菌和革蘭氏陽性菌均起作用。例如，Reed等將Shiva-Ia轉(zhuǎn)入小鼠中，轉(zhuǎn)基因小鼠對布魯氏桿菌的抵抗力顯著增強(qiáng)；Possani等的研究表明，在蚊體內(nèi)表達(dá)Shiva-3可以抑制瘧疾的傳播。

8、與傳統(tǒng)抗生素相比，某些抗菌肽的抗菌活性還不夠理想，改造已有抗菌肽和設(shè)計(jì)新抗菌肽分子是提高其產(chǎn)量及活性的有效途徑。例如，ChristsnenB等研究中得到的融合抗菌肽的抗菌活性比其任何一個(gè)供體抗菌肽的活性都高；Durasula等通過在長紅獵蟋的共生菌中表達(dá)CecropinA顯減少了其體內(nèi)錐蟲的數(shù)量。Cecropins是第一個(gè)被發(fā)現(xiàn)的動(dòng)物抗菌肽，1975年瑞典科學(xué)家從惜古比天蠶(Hyatophoracecropia)蛹中誘導(dǎo)分離得到。其中C

9、ecropinA對各種大腸桿菌和其他革蘭氏陰性菌如沙門氏菌具有很強(qiáng)的活性，對部分革蘭氏陽性菌也具有一定的殺傷活性。其作用機(jī)理不同于傳統(tǒng)抗生素，不會(huì)導(dǎo)致抗藥菌株的產(chǎn)生，且對正常的真核生物細(xì)胞及霉菌不起作用。由于抗菌肽的分子小，對蛋白酶非常敏感，因此很難直接大量表達(dá)而多采用融合表達(dá)策略以降低其對宿主細(xì)胞的毒性。綜上，能否通過基因融合配伍增強(qiáng)CecropinA及2A10scFv的抗病原作用及Cecrop-m2A10在蚊體內(nèi)的穩(wěn)定性呢?

10、 目的： 1.對鼠源性惡性瘧原蟲環(huán)子孢子蛋白單鏈抗體2A10基因進(jìn)行改造，構(gòu)建融合基因Cecrop-m2A10。 2.原核表達(dá)Cecrop-m2A10基因，并對其表達(dá)產(chǎn)物進(jìn)行生物學(xué)活性分析。 3.構(gòu)建以蚊眼特異性啟動(dòng)子(3xP3)驅(qū)動(dòng)的紅色熒光蛋白(DsRed)作為篩選標(biāo)志物，Vg啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)Cecrop-m2A10序列及高度特異性轉(zhuǎn)座元件piggyBac組成的具有完整調(diào)控元件的重組轉(zhuǎn)基因載體質(zhì)粒pBac-AsVg

11、-Cectop-m2A10。 方法： 1.根據(jù)按蚊偏嗜性密碼子對鼠源性惡性瘧原蟲環(huán)子孢子蛋白單鏈抗體2A10基因進(jìn)行改造，并融合按蚊抗菌肽CecropinA編碼基因，構(gòu)建融合基因Cecrop-m2A10及重組質(zhì)粒pBSK(+)-Cecrop-m2A10。 2.用PCR方法以pBSK(+)-Cecrop-m2A10為模板克隆Cecrop-m2A10基因，構(gòu)建表達(dá)重組質(zhì)粒pET32a(+)-Cecrop-m2A10，

12、并對重組質(zhì)粒進(jìn)行測序鑒定。 3.將重組質(zhì)粒pET32a(+)-Cecrop-m2A10轉(zhuǎn)入BL21(DE3)中，用IPTG誘導(dǎo)表達(dá)。 4.優(yōu)化工程菌pET32a(+)-Cecrop-mZA10的表達(dá)條件，大量誘導(dǎo)表達(dá)后對重組蛋白進(jìn)行純化。 5.Westernblotting鑒定重組表達(dá)蛋白。 6.采用瓊脂糖擴(kuò)散法檢測融合蛋白的體外抑菌活性。 7.運(yùn)用分子克隆技術(shù)，以pBSK(+)-Cecrop-m

13、2A10及pSLfall80fa-AsVg-CFP-3'VTR載體質(zhì)粒為基礎(chǔ)質(zhì)粒，構(gòu)建以蚊眼特異性啟動(dòng)子(3xP3)驅(qū)動(dòng)的紅色熒光蛋白(DsRed)作為篩選標(biāo)志物，Vg啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)Cecrop-m2A10序列及高度特異性轉(zhuǎn)座元件piggyBac組成的具有完整調(diào)控元件的重組轉(zhuǎn)基因載體質(zhì)粒pBac-AsVg-Cecrop-m2A10。 結(jié)果： 1.對鼠源性環(huán)子孢子蛋白單鏈抗體2A10中6種氨基酸的170個(gè)核苷酸進(jìn)行了改造并融合

14、CecropinA編碼基因，全基因合成法獲得融合基因Cecrop-m2A10。并成功構(gòu)建重組質(zhì)粒pBSK(+)-Cecrop-m2A10。 2.成功構(gòu)建表達(dá)重組質(zhì)粒pET32a(+)-Cecrop-m2A10，測序結(jié)果顯示讀碼框架正確。通過IPTG誘導(dǎo)得到以包涵體形式高效表達(dá)的重組蛋白。包涵體經(jīng)過尿素洗滌，變性，透析復(fù)性后純度達(dá)83.7％。Westernblotting分析顯示重組蛋白與抗6-His抗體可產(chǎn)生59KD大小的特異性

15、反應(yīng)條帶。 3.瓊脂糖擴(kuò)散法結(jié)果顯示，純化的重組蛋白具備抗大腸桿菌DH5α的活性。 4.成功構(gòu)建了以蚊眼特異性啟動(dòng)子(3xP3)驅(qū)動(dòng)的紅色熒光蛋白(DsRed)作為篩選標(biāo)志物，Vg啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)Cecrop-m2A10序列及高度特異性轉(zhuǎn)座元件piggyBac組成的具有完整調(diào)控元件的重組轉(zhuǎn)基因載體質(zhì)粒pBac-AsVg-Cecrop-m2A10。 結(jié)論： 1.成功構(gòu)建融合基因Cecrop-m2A10。

16、2.成功構(gòu)建表達(dá)重組質(zhì)粒pET32a(+)-Cecrop-m2A10。在大腸桿菌中以包涵體形式高效表達(dá)，純化后純度達(dá)83.7％。 3.初步鑒定顯示純化的重組蛋白具備抗大腸桿菌DH5α的活性。 4.構(gòu)建了以蚊眼特異性啟動(dòng)子(3xP3)驅(qū)動(dòng)的紅色熒光蛋白(DsRed)作為篩選標(biāo)志物，Vg啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)Cecrop-m2A10序列及高度特異性轉(zhuǎn)座元件piggyBac組成的具有完整調(diào)控元件的重組轉(zhuǎn)基因載體質(zhì)粒pBac-AsVg-Ce