Cecrop-m2A10融合基因的構建、原核表達、生物學活性分析及轉(zhuǎn)基因體系的構建.pdf

1、研究背景：蚊媒可傳播多種疾病，如：瘧疾(malaria)、流行性乙型腦炎(epidemicencepha]itisB)、絲蟲病(filariasis)、登革熱(denguefever)等，是嚴重威脅人民生命健康的重要疾病。一些蚊媒病如登革熱的發(fā)病率呈逐年遞增的趨勢并常有局部暴發(fā)流行。瘧疾是世界上感染率最高，死亡人數(shù)最多的疾病之一。每年有超過30億人受到瘧疾的威脅，死亡人數(shù)達200余萬。造成這種嚴重局面的最主要原因是缺乏預防瘧疾的有效措施

2、以及蚊媒和病原不斷產(chǎn)生耐藥性。因此探索并開發(fā)新的防治蚊媒疾病的措施已成為當前迫切需要解決的問題，控制昆蟲媒介再次成為最有效且實用的抗瘧手段。 瘧原蟲是人體瘧疾的病原體，共有四種類型，在我國主要是間日瘧原蟲和惡性瘧原蟲。人體瘧原蟲需要人和雌性按蚊做宿主，它在蚊體內(nèi)的發(fā)育包括在蚊胃腔內(nèi)進行有性生殖即配子生殖(gametogony)和在蚊胃壁進行的無性生殖即孢子增殖(sporogony)兩個階段。子孢子是瘧原蟲感染人體的階段。惡性瘧原

3、蟲環(huán)子孢子蛋白(Ciroumsporozoiteprotein，CSP)覆蓋于子孢子表面，是其重要保護性抗原及粘附入侵靶細胞的物質(zhì)基礎。惡性瘧CSP的鼠源單克隆抗體2A10在體外能夠阻止子孢子進入蚊唾液腺和人肝細胞。2A10scFv(single-chainFvantibodyfragment)是2A10單鏈抗體可變區(qū)片段。在以鼠源性2A10scFv為靶基因的轉(zhuǎn)基因蚊中，蚊體內(nèi)所表達的2A10scFv能夠與子孢子結合，從而阻斷其鉆入唾液

4、腺。但由于蛋白的表達量不高，因此未能達到完全阻斷子孢子入侵的效果。 近年來，國際上提出了利用轉(zhuǎn)基因技術對蚊媒進行遺傳修飾以控制蚊媒疾病的新策略。外源基因在轉(zhuǎn)基因蚊體內(nèi)的表達對于轉(zhuǎn)基因蚊的抗病原效應至關重要，它受到啟動子、插入部位及外源基因本身特性等諸多因素的影響。其中，外源基因的密碼子在宿主蚊體內(nèi)的使用頻率，即遺傳密碼子的偏嗜性被認為是一個重要影響因素。物種間編碼同一氨基酸的不同密碼子的使用頻率存在差別，一些在外源基因中出現(xiàn)的密

5、碼子很少為表達宿主所使用，相對應的tRNA在宿主體內(nèi)稀少，由此影響了外源基因mRNA的翻譯過程，從而降低了效應蛋白的表達量。在對于大腸桿菌偏嗜性人胰島素樣生長因子1的研究中，實驗人員依據(jù)大腸桿菌遺傳密碼子使用頻率表，人工合成3條DNA單鏈，PCR拼接擴增出適于在大腸桿菌中表達的人IGF-1基因。所構建的大腸桿菌偏嗜性人IGF-1基因可顯著提高rhIGF=1的產(chǎn)率。此外將異源的免疫原基因密碼子優(yōu)化為免疫接種動物偏嗜性密碼子能夠提高抗原表達

6、效率并改進DNA疫苗免疫效果也己被許多研究所證實。本實驗中經(jīng)對比分析，鼠源性2A10scFv基因中有些密碼子在蚊體內(nèi)的使用頻率確實很低，例如，編碼絲氨酸的密碼子UCU在岡比亞按蚊的使用頻率僅為4.1‰。那么我們能否通過2A10scFv基因密碼子的蚊偏嗜性改造，使其更適于在轉(zhuǎn)基因蚊體內(nèi)表達從而提高其表達量、增加其穩(wěn)定性及生物學活性呢? 抗菌肽(antimicrobialpeptides，AMP)是抗菌活性短肽的總稱。目前已發(fā)現(xiàn)抗菌

7、肽或類似的小分子肽類廣泛存在于生物界，包括細菌、動植物和人類。內(nèi)源性的抗菌肽經(jīng)誘導合成，在機體抵抗病原的入侵方面起著重要的作用，被認為是缺乏特異性免疫功能生物的重要防御成分。抗菌肽具有廣譜殺菌作用，大多數(shù)對革蘭氏陽性菌有較強的殺滅作用，有些則對革蘭氏陰性菌和革蘭氏陽性菌均起作用。例如，Reed等將Shiva-Ia轉(zhuǎn)入小鼠中，轉(zhuǎn)基因小鼠對布魯氏桿菌的抵抗力顯著增強；Possani等的研究表明，在蚊體內(nèi)表達Shiva-3可以抑制瘧疾的傳播。

8、與傳統(tǒng)抗生素相比，某些抗菌肽的抗菌活性還不夠理想，改造已有抗菌肽和設計新抗菌肽分子是提高其產(chǎn)量及活性的有效途徑。例如，ChristsnenB等研究中得到的融合抗菌肽的抗菌活性比其任何一個供體抗菌肽的活性都高；Durasula等通過在長紅獵蟋的共生菌中表達CecropinA顯減少了其體內(nèi)錐蟲的數(shù)量。Cecropins是第一個被發(fā)現(xiàn)的動物抗菌肽，1975年瑞典科學家從惜古比天蠶(Hyatophoracecropia)蛹中誘導分離得到。其中C

9、ecropinA對各種大腸桿菌和其他革蘭氏陰性菌如沙門氏菌具有很強的活性，對部分革蘭氏陽性菌也具有一定的殺傷活性。其作用機理不同于傳統(tǒng)抗生素，不會導致抗藥菌株的產(chǎn)生，且對正常的真核生物細胞及霉菌不起作用。由于抗菌肽的分子小，對蛋白酶非常敏感，因此很難直接大量表達而多采用融合表達策略以降低其對宿主細胞的毒性。綜上，能否通過基因融合配伍增強CecropinA及2A10scFv的抗病原作用及Cecrop-m2A10在蚊體內(nèi)的穩(wěn)定性呢?

10、 目的： 1.對鼠源性惡性瘧原蟲環(huán)子孢子蛋白單鏈抗體2A10基因進行改造，構建融合基因Cecrop-m2A10。 2.原核表達Cecrop-m2A10基因，并對其表達產(chǎn)物進行生物學活性分析。 3.構建以蚊眼特異性啟動子(3xP3)驅(qū)動的紅色熒光蛋白(DsRed)作為篩選標志物，Vg啟動子驅(qū)動Cecrop-m2A10序列及高度特異性轉(zhuǎn)座元件piggyBac組成的具有完整調(diào)控元件的重組轉(zhuǎn)基因載體質(zhì)粒pBac-AsVg

11、-Cectop-m2A10。 方法： 1.根據(jù)按蚊偏嗜性密碼子對鼠源性惡性瘧原蟲環(huán)子孢子蛋白單鏈抗體2A10基因進行改造，并融合按蚊抗菌肽CecropinA編碼基因，構建融合基因Cecrop-m2A10及重組質(zhì)粒pBSK(+)-Cecrop-m2A10。 2.用PCR方法以pBSK(+)-Cecrop-m2A10為模板克隆Cecrop-m2A10基因，構建表達重組質(zhì)粒pET32a(+)-Cecrop-m2A10，

12、并對重組質(zhì)粒進行測序鑒定。 3.將重組質(zhì)粒pET32a(+)-Cecrop-m2A10轉(zhuǎn)入BL21(DE3)中，用IPTG誘導表達。 4.優(yōu)化工程菌pET32a(+)-Cecrop-mZA10的表達條件，大量誘導表達后對重組蛋白進行純化。 5.Westernblotting鑒定重組表達蛋白。 6.采用瓊脂糖擴散法檢測融合蛋白的體外抑菌活性。 7.運用分子克隆技術，以pBSK(+)-Cecrop-m

13、2A10及pSLfall80fa-AsVg-CFP-3'VTR載體質(zhì)粒為基礎質(zhì)粒，構建以蚊眼特異性啟動子(3xP3)驅(qū)動的紅色熒光蛋白(DsRed)作為篩選標志物，Vg啟動子驅(qū)動Cecrop-m2A10序列及高度特異性轉(zhuǎn)座元件piggyBac組成的具有完整調(diào)控元件的重組轉(zhuǎn)基因載體質(zhì)粒pBac-AsVg-Cecrop-m2A10。 結果： 1.對鼠源性環(huán)子孢子蛋白單鏈抗體2A10中6種氨基酸的170個核苷酸進行了改造并融合

14、CecropinA編碼基因，全基因合成法獲得融合基因Cecrop-m2A10。并成功構建重組質(zhì)粒pBSK(+)-Cecrop-m2A10。 2.成功構建表達重組質(zhì)粒pET32a(+)-Cecrop-m2A10，測序結果顯示讀碼框架正確。通過IPTG誘導得到以包涵體形式高效表達的重組蛋白。包涵體經(jīng)過尿素洗滌，變性，透析復性后純度達83.7％。Westernblotting分析顯示重組蛋白與抗6-His抗體可產(chǎn)生59KD大小的特異性

15、反應條帶。 3.瓊脂糖擴散法結果顯示，純化的重組蛋白具備抗大腸桿菌DH5α的活性。 4.成功構建了以蚊眼特異性啟動子(3xP3)驅(qū)動的紅色熒光蛋白(DsRed)作為篩選標志物，Vg啟動子驅(qū)動Cecrop-m2A10序列及高度特異性轉(zhuǎn)座元件piggyBac組成的具有完整調(diào)控元件的重組轉(zhuǎn)基因載體質(zhì)粒pBac-AsVg-Cecrop-m2A10。 結論： 1.成功構建融合基因Cecrop-m2A10。

16、2.成功構建表達重組質(zhì)粒pET32a(+)-Cecrop-m2A10。在大腸桿菌中以包涵體形式高效表達，純化后純度達83.7％。 3.初步鑒定顯示純化的重組蛋白具備抗大腸桿菌DH5α的活性。 4.構建了以蚊眼特異性啟動子(3xP3)驅(qū)動的紅色熒光蛋白(DsRed)作為篩選標志物，Vg啟動子驅(qū)動Cecrop-m2A10序列及高度特異性轉(zhuǎn)座元件piggyBac組成的具有完整調(diào)控元件的重組轉(zhuǎn)基因載體質(zhì)粒pBac-AsVg-Ce