沙棘木蠹蛾白僵菌高毒菌株篩選和幾丁質(zhì)酶基因克隆及其微膠囊制劑的研究.pdf

1、沙棘（Hippophae rhamnoides L. subsp. sinensis Rousi）是我國(guó)黃土丘陵區(qū)生態(tài)建設(shè)、經(jīng)濟(jì)樹種之一，在內(nèi)蒙古、遼寧等地分布面積廣。沙棘木蠹蛾（Holcocerus hippophaecolus Hua，Chou，F(xiàn)ang et Chen）鉆蛀危害沙棘干和根部，造成沙棘大面積死亡。球孢白僵菌(Beauveria. bassiana)侵染沙棘木蠹蛾幼蟲和蛹，導(dǎo)致其死亡。為更好利用白僵菌防治沙棘木蠹蛾，本

2、文從菌株篩選、酶活性、幾丁質(zhì)酶基因克隆、分生孢子萌發(fā)促進(jìn)劑、微膠囊研制及其生物測(cè)定等方面對(duì)寄生于沙棘木蠹蛾的球孢白僵菌進(jìn)行了比較系統(tǒng)的研究，主要內(nèi)容包括：
　　1.白僵菌菌株篩選：從病死沙棘木蠹蛾幼蟲和蛹中分離純化得到5株球孢白僵菌菌株。室內(nèi)通過比較生長(zhǎng)速度、產(chǎn)孢量、萌發(fā)速度、不同溫、濕度下的分生孢子萌發(fā)率、對(duì)高溫的耐性、抗紫外線照射等方面篩選優(yōu)良菌株。結(jié)果表明，SJ-05菌株的各項(xiàng)生長(zhǎng)指標(biāo)較優(yōu)秀。SJ-05在76％的濕度下萌發(fā)率

3、為60％，是SJ-03的2.5倍。50℃高溫脅迫18 min，SJ-05的萌發(fā)率為48.77%，是SJ-03的2.5倍。紫外線持續(xù)照射8 h，SJ-05萌發(fā)率最高為33.92%是SJ-02的2.0倍。表明SJ-05菌株抗低濕能力、耐熱性和抗紫外照射能力強(qiáng)，為優(yōu)良菌株。
　　2.白僵菌菌株酶活性及幾丁質(zhì)酶基因克?。翰捎闷桨鍦y(cè)定法和Lowry及DNS測(cè)定法對(duì)白僵菌菌株胞外蛋白酶和幾丁質(zhì)酶活性進(jìn)行測(cè)定。優(yōu)良菌株SJ-05胞外蛋白酶產(chǎn)量為

4、55.3 U/mL，幾丁質(zhì)酶產(chǎn)量為137.9 U/mL，分別是菌株SJ-01的3.5倍和4.3倍?？寺〉玫角蜴甙捉┚鷰锥≠|(zhì)酶基因，其核苷酸序列閱讀框架全長(zhǎng)1047 bp，編碼348個(gè)氨基酸。推測(cè)其分子量為36.9 KDa，等電點(diǎn)為5.94，可能是從球孢白僵菌中克隆的一新幾丁質(zhì)酶基因。
　　3.營(yíng)養(yǎng)液、酸堿度、繼代培養(yǎng)及促進(jìn)劑對(duì) SJ-05孢子萌發(fā)的影響：1%蛋白胨、1%蔗糖和1%蠶蛹表皮3種營(yíng)養(yǎng)液都可促進(jìn)孢子萌發(fā)。孢子萌發(fā)最適pH

5、值為6.0～7.0。培養(yǎng)第5代后，SJ-05分生孢子的萌發(fā)率、萌發(fā)速度均明顯下降，培養(yǎng)16h時(shí)，第3代的萌發(fā)率為97%，第4代的萌發(fā)率為87%，第5代的萌發(fā)率僅為40%。AA、BB兩種促進(jìn)劑對(duì)白僵菌分生孢子的萌發(fā)有明顯促進(jìn)作用，并隨濃度的增大對(duì)孢子萌發(fā)的促進(jìn)作用均有不同程度的增強(qiáng)，培養(yǎng)14 h和18 h時(shí)，1.5 ppm AA、BB兩種促進(jìn)劑中孢子萌發(fā)率高，分別為46%和96%，分別是對(duì)照組的2.6倍和2.5倍。促進(jìn)劑CC對(duì)分生孢子萌發(fā)

6、率的促進(jìn)作用不明顯，高濃度時(shí)有一定抑制作用。
　　4.微膠囊的研制與性能測(cè)定：用界面聚合法對(duì)SJ-05分生孢子制備微膠囊，通過4因素4水平正交試驗(yàn)，C含量100%、E含量0.5%、F濃度0.5 M、轉(zhuǎn)速500 r/min是制備微膠囊的最優(yōu)組合。在61%濕度下，SJ-05微膠囊孢子萌發(fā)率為33.85%，分生孢子菌懸液不萌發(fā)。微膠囊與分生孢子懸液經(jīng)30W、40cm處紫外線照射后的孢子萌發(fā)率均下降，但是微膠囊有一定的抗紫外能力。紫外照射

7、10 h，微膠囊孢子萌發(fā)率26.91%，分生孢子懸液孢子萌發(fā)率僅3.92%。
　　5.生物測(cè)定：室內(nèi)模擬野外條件，SJ-05分生孢子及微膠囊對(duì)沙棘木蠹蛾幼蟲的的致死率分別為45.54%和84.54%，說明SJ-05微膠囊對(duì)沙棘木蠹蛾幼蟲的侵染明顯高于其分生孢子。同時(shí)，室內(nèi)測(cè)定SJ-05對(duì)枸杞負(fù)泥蟲幼蟲、落葉松毛蟲幼蟲及沙棘木蠹蛾幼蟲的侵染，SJ-05分生孢子對(duì)三種害蟲幼蟲的LC50分別為3.45×107個(gè)孢子/mL、2.92×10