HaSNPV幾丁質(zhì)酶基因多拷貝重組菌株的篩選、表達(dá)、鑒定及其產(chǎn)酶條件的優(yōu)化.pdf

1、棉鈴蟲是我國(guó)重要的農(nóng)業(yè)害蟲之一，常常造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失。而化學(xué)農(nóng)藥長(zhǎng)期大量的使用，不僅使得棉鈴蟲的抗藥性劇增，且污染環(huán)境。棉鈴蟲單核衣殼核多角體病毒(HaSNPV)是棉鈴蟲專一性病原微生物，具有寄主范圍特異、對(duì)靶標(biāo)高毒力、無(wú)藥害、使用安全、害蟲不產(chǎn)生抗藥性等優(yōu)點(diǎn)，是理想的害蟲控制因子。但傳統(tǒng)病毒殺蟲劑殺蟲作用緩慢、范圍窄等限制了它的使用。在HaSNPV基因組中發(fā)現(xiàn)的18家族幾丁質(zhì)酶基因是一個(gè)晚期非必需基因，與受染蟲體液化和病毒侵染機(jī)制密

2、切相關(guān)，因而對(duì)該基因進(jìn)行深入研究，將對(duì)病毒殺蟲劑的遺傳改良和新的表達(dá)系統(tǒng)的建立有著重要的意義。 為了克服前期實(shí)驗(yàn)HaSNPV幾丁質(zhì)酶基因在原核表達(dá)系統(tǒng)中存在的不易分離純化、蛋白無(wú)活性等問(wèn)題，本研究嘗試使用真核表達(dá)系統(tǒng)。實(shí)驗(yàn)中，首先將目的基因克隆構(gòu)建到真核表達(dá)質(zhì)粒pPIC9K中，測(cè)序鑒定重組子正確后，電轉(zhuǎn)化畢赤酵母GSll5感受態(tài)細(xì)胞。經(jīng)MM和MD平板篩選，獲得了表型為Mut的轉(zhuǎn)化子；在此基礎(chǔ)上，再經(jīng)過(guò)遺傳霉素梯度抗性的篩選。該重