谷胱甘肽過氧化物酶基因多拷貝重組菌株的篩選、表達、鑒定及其產(chǎn)酶條件的優(yōu)化.pdf

1、研究目的:磷脂氫谷胱甘肽過氧化物酶（PHGPx）是一類重要抗氧化酶，在動物細胞中它能夠直接還原磷脂氫過氧化物保護生物膜。植物中也廣泛分布有PHGPx，在對植物PHGPx 進行了大量篩查的基礎(chǔ)上，發(fā)現(xiàn)蘿卜PHGPx（RsPHGPx）其活性中心含有半胱氨酸,實驗表明該蛋白具有保護小鼠成纖維細胞NIH-3T3 或黑色素瘤B16細胞免受由過氧化氫或紫外輻射所介導的損傷，證明了其結(jié)構(gòu)與活性都和動物中PHGPx 相似，介于它在抗氧化以及抗衰老方面具

2、有的潛在應(yīng)用價值，所以需要大量獲得高活性的RsPHGPx 蛋白質(zhì)。
　　 研究方法:將蘿卜磷脂氫谷胱甘肽過氧化物酶（RsPHGPx）基因插入到分泌表達載體pPIC9K 中，轉(zhuǎn)化巴斯德畢赤酵母GS115細胞，并篩選出高抗性G418的轉(zhuǎn)化子。經(jīng)過優(yōu)化表達條件，RsPHGPx 在1％甲醇、pH6.0、28℃條件下誘導60 小時后得到最大表達量，通過硫酸銨分級沉淀、脫鹽柱脫鹽、凝膠過濾等純化步驟，并對純化獲得的RsPHGPx 進行活性分

3、析。并用質(zhì)譜鑒定目的蛋白。
　　 研究結(jié)果:本研究采用畢赤酵母多拷貝表達系統(tǒng)，相對于本實驗室已在大腸桿菌細胞中成功表達出該蛋白質(zhì)表達量更大，而且由于是胞外表達，純化步驟更加簡便，活性也更高，蛋白產(chǎn)量約為102 mg/L，蛋白純度在90％以上，活性分析顯示純化獲得的RsPHGPx具有依賴于GSH的還原活性，在以H2O2 為底物的條件下，比活性為4.2μmol/min mg。
　　 質(zhì)譜鑒定蛋白方法更加快捷，結(jié)果較為準確可靠