谷胱甘肽過(guò)氧化物酶基因多拷貝重組菌株的篩選、表達(dá)、鑒定及其產(chǎn)酶條件的優(yōu)化.pdf

1、研究目的:磷脂氫谷胱甘肽過(guò)氧化物酶（PHGPx）是一類重要抗氧化酶，在動(dòng)物細(xì)胞中它能夠直接還原磷脂氫過(guò)氧化物保護(hù)生物膜。植物中也廣泛分布有PHGPx，在對(duì)植物PHGPx 進(jìn)行了大量篩查的基礎(chǔ)上，發(fā)現(xiàn)蘿卜PHGPx（RsPHGPx）其活性中心含有半胱氨酸,實(shí)驗(yàn)表明該蛋白具有保護(hù)小鼠成纖維細(xì)胞NIH-3T3 或黑色素瘤B16細(xì)胞免受由過(guò)氧化氫或紫外輻射所介導(dǎo)的損傷，證明了其結(jié)構(gòu)與活性都和動(dòng)物中PHGPx 相似，介于它在抗氧化以及抗衰老方面具

2、有的潛在應(yīng)用價(jià)值，所以需要大量獲得高活性的RsPHGPx 蛋白質(zhì)。
　　 研究方法:將蘿卜磷脂氫谷胱甘肽過(guò)氧化物酶（RsPHGPx）基因插入到分泌表達(dá)載體pPIC9K 中，轉(zhuǎn)化巴斯德畢赤酵母GS115細(xì)胞，并篩選出高抗性G418的轉(zhuǎn)化子。經(jīng)過(guò)優(yōu)化表達(dá)條件，RsPHGPx 在1％甲醇、pH6.0、28℃條件下誘導(dǎo)60 小時(shí)后得到最大表達(dá)量，通過(guò)硫酸銨分級(jí)沉淀、脫鹽柱脫鹽、凝膠過(guò)濾等純化步驟，并對(duì)純化獲得的RsPHGPx 進(jìn)行活性分

3、析。并用質(zhì)譜鑒定目的蛋白。
　　 研究結(jié)果:本研究采用畢赤酵母多拷貝表達(dá)系統(tǒng)，相對(duì)于本實(shí)驗(yàn)室已在大腸桿菌細(xì)胞中成功表達(dá)出該蛋白質(zhì)表達(dá)量更大，而且由于是胞外表達(dá)，純化步驟更加簡(jiǎn)便，活性也更高，蛋白產(chǎn)量約為102 mg/L，蛋白純度在90％以上，活性分析顯示純化獲得的RsPHGPx具有依賴于GSH的還原活性，在以H2O2 為底物的條件下，比活性為4.2μmol/min mg。
　　 質(zhì)譜鑒定蛋白方法更加快捷，結(jié)果較為準(zhǔn)確可靠