交枝頂孢霉與枝狀枝孢霉的殺螨（蟲）活性及其遺傳轉化研究.pdf

1、蟲生真菌以其寄主廣泛，不易產生抗性，生產工藝簡單，對環(huán)境友好等優(yōu)點成為國內外生物防治研究的熱點。我國蟲生真菌資源豐富，但是能夠防治葉螨的病原真菌報道較少。本實驗室從田間采集的柑橘全爪螨Panonychus citri（McGregor）螨尸上分離到2株病原真菌，分別鑒定為交枝頂孢霉Sarocladium implicatum CQBBW8（簡稱CQBBW8）與枝狀枝孢霉Cladosporium cladosporioides CQBBW

2、3（簡稱CQBBW3）。為加強對這2個菌株的了解，為生物殺螨真菌制劑的開發(fā)奠定理論基礎，本文對這2個菌株進行了殺螨活性、生物學特性、殺蟲機理以及遺傳轉化等方面的研究，結果如下：
　　CQBBW8菌株殺柑橘全爪螨活性較好，LC50值為1.2×106個孢子/mL，LT50值為5.1759 d，好于CQBBW3菌株的LC50值4.66×108個孢子/mL和LT50值6.2353 d。生物學特性研究發(fā)現，CQBBW8菌株在PDA培養(yǎng)基上菌

3、絲生長最快，在SEA培養(yǎng)基上產孢量最大；而CQBBW3菌株在淀粉瓊脂培養(yǎng)基上菌絲生長最快，在查氏培養(yǎng)基上產孢最大。2個菌株均在以甘露醇為碳源、蛋白胨為氮源的培養(yǎng)基上菌絲生長最快，最適生長及孢子萌發(fā)溫度為25℃，CQBBW8菌株的最適產孢溫度為30℃，而CQBBW3菌株的最適產孢的溫度為15℃；2個株菌均在pH為6.0～8.0范圍內生長和產孢較好，分生孢子在強酸性環(huán)境下萌發(fā)率更高；紫外線對2個菌株的生長和產孢有一定的影響，對孢子有很強的殺

4、傷作用。此外，2個菌株與殺菌劑氧化亞銅和5種殺螨劑的相容性均較好，在田間可以互配使用。
　　采用―浸漬法‖分別測定了CQBBW8與CQBBW3菌株對家蠶4齡幼蟲及蠶蛹的致病力，并采用福林酚試劑法和幾丁質酶活試劑盒測定了2個菌株在蟬蛻培養(yǎng)基中胞外蛋白酶與幾丁質酶的表達情況。結果顯示，CQBBW8與CQBBW3菌株對家蠶幼蟲的校正死亡率、LT50值以及對蠶蛹的LC50值分別為80.00%、4.3439 d、9.4817×108個孢子/

5、mL與69.99%、5.5697 d、1.26×1010個孢子/mL，CQBBW8菌株的殺蟲效果更好。從CQBBW8與CQBBW3菌株在蟬蛻誘導培養(yǎng)基中產胞外蛋白酶和幾丁質酶的變化趨勢表明，蛋白酶和幾丁質酶均增強表達，在降解蟬蛻的過程中二者作用順序相同，但蛋白酶起主要作用。比較分析這2個菌株蛋白酶與幾丁質酶活性的變化趨勢，發(fā)現CQBBW8比CQBBW3菌株分解體壁蛋白質和幾丁質的能力更強。
　　柑橘全爪螨被CQBBW8與CQBBW

6、3菌株分別侵染后，螨體內的3種解毒酶活性發(fā)生了不同程度的變化，響應順序均為：谷胱甘肽-S-轉移酶（GSTs）、羧酸酯酶（CarE）、乙酰膽堿酯酶（AchE）。三種酶活均呈先上升后下降的趨勢，GSTs活性從第1 d就快速上升，CQBBW8與CQBBW3菌株侵染引起的最大酶活分別出現在第3、4 d，為8.13、6.53 U/mL prot；CarE活性從第2 d開始快速上升，2個菌株的侵染引起的酶活高峰也分別出現在第3、4 d，分別為12.

7、98、10.06 U/mL prot；Ac hE活性從第3天開始快速上升，且均在第4 d酶活性最大分別為0.1818、0.1120 U/mL prot；3種解毒酶活均在4-5 d開始快速下降，在第6、7 d接近或低于對照，說明螨體接近死亡。
　　利用根癌農桿菌介導轉化（Agrobacterium tumefaciens-mediated transformation，ATMT）構建CQBBW8菌株的T-DNA隨機插入突變體庫，分析

8、表型突變菌株相關基因的功能。結果顯示，遺傳轉化體系的轉化效率為100-200個轉化子/106個孢子，從構建的含有2800個轉化子的突變體庫中篩選出41株表型變化較大的轉化子。采用Hi-TAIL PCR技術擴增到9株突變子的T-DNA插入位點側翼序列，將獲得側翼序列與CQBBW8菌株的基因組數據進行比對分析，得到相應基因為：寡肽轉運蛋白（OPT）（B11轉化子）、RNA聚合酶II轉錄因子（B36轉化子）、延胡索酰乙酰乙酸（FAA）水解酶（