輪枝鐮孢(Fusarium verticillioide)五種疏水蛋白的功能研究.pdf

1、疏水蛋白是由絲狀真菌特異產(chǎn)生的一類分泌型小分子蛋白質(zhì)，分子量在10kDa左右，疏水蛋白最主要的特點(diǎn)是其肽鏈含有8個(gè)半胱氨酸，形成四個(gè)鏈內(nèi)二硫鍵。疏水蛋白能夠在疏水介質(zhì)的表面自我折疊，改變介質(zhì)表面的疏水或親水特性，在真菌菌絲的生長(zhǎng)發(fā)育，孢子的擴(kuò)散傳播以及病原真菌致病性上都有重要的功能。先期研究表明部分真菌疏水蛋白具有凝集素性質(zhì)，而凝集素在分子識(shí)別中發(fā)揮著重要作用。本研究選取輪枝鐮孢（Fusarium verticillioide）的五種疏

2、水蛋白基因作為研究對(duì)象，研究它們表達(dá)產(chǎn)物的凝集活性以及與輪枝鐮孢的寄生性真菌纖細(xì)齒梗孢（Olpitrichum tenellum）互作中的功能。
　　 根據(jù)GenBank中注冊(cè)的三種疏水蛋白基因序列設(shè)計(jì)引物，通過(guò)RT-PCR擴(kuò)增得到輪枝鐮孢的三種疏水蛋白基因FvHYD3、FvHYD4及FvHYD5，構(gòu)建了三種基因及FvHYD3與嗜熱子囊菌光孢變種（Thermoascus aurantiacus var.levisporus）纖維

3、素酶基因eg1融合基因的重組酵母表達(dá)載體，分別命名為pPIC9K/HYD3、pPIC9K/HYD4、pPIC9K/HYD5和pPIC9K/HYD3-eg1，轉(zhuǎn)化酵母菌株GS115后篩選獲得酵母工程菌株G-HYD3、G-HYD4、G-HYD5、G-HYD3-eg1，將上述工程菌株和含有疏水蛋白基因FvHYD1和FvHYD2的酵母工程菌株G-HydⅠ和G-HydⅡ進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，純化后的產(chǎn)物分別命名為Hyrophobin3、Hyrophobi

4、n4、Hyrophobin5、融合蛋白R(shí)H及Hyrophobin1、Hyrophobin2，Western-blot驗(yàn)證表明我們獲得的純化產(chǎn)物為疏水蛋白。
　　 五種疏水蛋白分別對(duì)兔血紅細(xì)胞、輪枝鐮孢（F.verticillioide）孢子、九州鐮孢菌(Fusarium kyushuense）的孢子以及纖細(xì)齒梗孢(O.tenellum)的孢子進(jìn)行凝集反應(yīng)，結(jié)果表明五種蛋白都具有明顯的凝集活性，但是每種蛋白對(duì)不同孢子的凝集活性不同

5、，并且部分糖溶液和金屬離子對(duì)疏水蛋白的凝集活性有影響。融合蛋白的研究表明RH能夠吸附于酵母菌體和疏水介質(zhì)聚氯乙烯表面，表明疏水蛋白具有極強(qiáng)的粘附特性，并且該性質(zhì)與疏水蛋白的凝集活性密切相關(guān)。為了深入研究寄生性真菌纖細(xì)齒梗孢對(duì)輪枝鐮孢的初始分子識(shí)別機(jī)制，本實(shí)驗(yàn)將輪枝鐮孢（F.verticillioide）五種疏水蛋白基因進(jìn)行敲除，采用PEG介導(dǎo)轉(zhuǎn)化法，經(jīng)過(guò)潮霉素抗性篩選，成功獲得了FvHYD5基因缺失的突變體，但是兩者互作研究沒(méi)有表型差異

6、。
　　 選取Hyrophobin3、Hyrophobin4及Hyrophobin5的純化產(chǎn)物與玉米葉片互作，透析液作為對(duì)照，研究表明Ⅱ型疏水蛋白Hyrophobin4和Hyrophobin5能夠誘導(dǎo)玉米防御反應(yīng)酶的表達(dá)，Hyrophobin4能夠顯著提高防御反應(yīng)酶的活性，Hyrophobin5雖能引起防衛(wèi)反應(yīng)酶活性的提高，但是效果并不顯著。此外，將Hyrophobin4注入玉米髓部組織，結(jié)果表明該蛋白能夠顯著提高玉米髓部組織防

7、御反應(yīng)相關(guān)酶的活性，特別是POD酶活性。
　　 通過(guò)以上的研究工作，表明了輪枝鐮孢（F.verticillioide）五種疏水蛋白具有凝集活性，輪枝鐮孢Hyrophobin1、Hyrophobin2、Hyrophobin3及Hyrophobin4對(duì)其寄生性真菌纖細(xì)齒梗孢(O.tenellum)的孢子具有凝集作用，這說(shuō)明疏水蛋白在兩種真菌的分子識(shí)別上發(fā)揮著一定作用，這些研究為菌寄生真菌的初始分子識(shí)別機(jī)制的研究提供了新的思路。目前Ⅱ