禾谷鐮孢菌(Fusarium graminearum)對(duì)氰烯菌酯的抗藥性機(jī)制研究.pdf

1、氰烯菌酯（2-氰基-3-氨基-3-苯基丙烯酸乙酯，試驗(yàn)號(hào)：JS399-19）是由國(guó)家南方農(nóng)藥創(chuàng)制中心江蘇基地最新合成的一種對(duì)鐮孢菌具有較高活性的化合物，特別是對(duì)禾谷鐮孢菌（Fusarium graminearum）菌絲生長(zhǎng)具有強(qiáng)烈的抑制活性，田間也具有良好的防效。但是在離體條件下，通過(guò)紫外誘變和藥劑馴化，禾谷鐮孢菌對(duì)氰烯茵酯較易產(chǎn)生抗藥性，且大部分抗藥性菌株都屬于中等抗性水平(MR)或高等抗性水平（HR.），抗性菌株的適合度并無(wú)明顯下降

2、，禾谷鐮孢菌對(duì)氰烯菌酯的室內(nèi)抗藥性具有高等至中等風(fēng)險(xiǎn)。在田間出現(xiàn)抗藥性之前研究禾谷鐮孢菌對(duì)氰烯茵酯的抗藥性機(jī)制，對(duì)科學(xué)制定該殺菌劑的應(yīng)用策略和檢測(cè)技術(shù)具有重要意義，
　　 本文建立了禾谷鐮孢菌原生質(zhì)體高效遺傳轉(zhuǎn)化技術(shù)平臺(tái)．以氰烯菌酯高抗（JS399.19tm）菌株Y2021A為供試菌株，優(yōu)化胞壁降解酶系統(tǒng)和潮霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶基因（hph）轉(zhuǎn)化系統(tǒng)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，制備禾谷鐮孢菌原生質(zhì)體最適宜的條件為每毫升2％Ddslase和2%Snai

3、lase混合酶液中加)x.0.129幼殖體，30℃酶解1.5 h，hph的轉(zhuǎn)化效率可以達(dá)到40-50個(gè)轉(zhuǎn)化子/ug DNA片段。
　　 利用禾谷鐮孢菌原生質(zhì)體高效遺傳轉(zhuǎn)化技術(shù)平臺(tái)，分別將hph和正負(fù)篩選標(biāo)記基因（hph-hsv）轉(zhuǎn)化到JS399-19nR菌株Y2021A中，建立隨機(jī)插入突變體文庫(kù)，并篩選氰烯菌酯敏感性突變體。本研究共獲得hph隨機(jī)插入突變體10163個(gè)，其中10125個(gè)能在loo ug/mL潮霉素B的PSA平板上

4、正常生長(zhǎng)，被認(rèn)定為hph隨機(jī)插入陽(yáng)性突變體，但這些陽(yáng)性突變體在10 ug/mL氰烯茵酯上均能正常生長(zhǎng)，表現(xiàn)出發(fā)菌株所表現(xiàn)的抗藥性；共獲得hph-hsv隨機(jī)插入突變體4745個(gè)，其中4336個(gè)能在loou/mL潮霉素B的PSA平板上正常生長(zhǎng)而不能在0.2M的F2du上生長(zhǎng)，被認(rèn)定為hph-hsv隨機(jī)插入陽(yáng)性突變體，在hph-hsv隨機(jī)插入陽(yáng)性突變體中有328個(gè)突變體對(duì)氰烯菌酯表現(xiàn)敏感，這些突變體被認(rèn)為是氰烯菌酯敏感性突變體，并被用來(lái)研究禾

5、谷鐮孢菌對(duì)氰烯菌酯抗藥性相關(guān)基因的材料。
　　 以氰烯菌酯敏感性突變體為研究材料，通過(guò)Tail-PCR擴(kuò)增hph-hsv的側(cè)翼序列，并與Fusarium graminearum基因文庫(kù)進(jìn)行比對(duì)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)hph-hsv插入在tubulin betachain(FGSG06611.3)（b2-tub）中．經(jīng)PCR、測(cè)序、Southern blot和RT-PCR的進(jìn)一步驗(yàn)證，hph-hsv不是插入到p2-tub中，而是替換了肪-tub

6、的編碼區(qū)．將不同抗藥性水平茵株與禾谷鐮孢菌野生型菌株2021的32-tub進(jìn)行比對(duì)，發(fā)現(xiàn)其·微管蛋白的12、17、21、22、41和74位氨基酸分別發(fā)生了不同的改變．
　　 通過(guò)對(duì)禾谷鐮孢菌野生型菌株2021和JS399-19HR菌株JT04.-4的132-tub敲除體/回復(fù)體和JS399-19脹菌株Y2021A的敏感性突變體研究，結(jié)果表明，氰烯菌酯對(duì)野生型菌株2021132-tub敲除體和敏感性突變體的生長(zhǎng)抑制中濃度ECso值

7、與對(duì)野生型菌株2021的ECso值沒(méi)有顯著差異，但是最低抑制濃度MIC值下降了4倍。JS399-19tm菌株JT04-42-tub敲除體對(duì)氰烯茵酯抗性水平下降，表現(xiàn)中抗．與野生型菌株2021相比，32-tub敲除體和敏感性突變體的菌絲生長(zhǎng)速率、產(chǎn)分生孢子能力、產(chǎn)子裳殼能力及致病力均顯著下降，但是敏感性突變體較132-tub敲除體下降的幅度小，不同類(lèi)型菌株的p2-tub回復(fù)體對(duì)氰烯菌酯則表現(xiàn)出與出發(fā)菌株相同的抗藥性水平，其菌絲生長(zhǎng)速率、產(chǎn)

8、分生孢子能力、產(chǎn)子囊殼能力及致病力也基本恢復(fù)。本研究結(jié)果表明，fl2-mb基因敲除和hph-hsv插入缺失是禾谷鐮孢菌對(duì)氰烯菌酯抗藥性下降和喪失的重要機(jī)制．
　　 通過(guò)禾谷鐮孢菌蛋白質(zhì)雙向電泳圖譜分析，研究了氰烯菌酯對(duì)野生型敏感菌株2021和JS399-19rm菌株Y2021A蛋白質(zhì)組學(xué)的影響．用EC90（0.5ug/mL）濃度的氰烯菌酯處理野生敏感菌株2021和JS399-19HR菌株Y2021A12h，同時(shí)以不加藥劑作為對(duì)照

9、，獲得敏感菌株經(jīng)藥劑處理以后蛋白質(zhì)表達(dá)量發(fā)生顯著變化，而抗藥性菌株未發(fā)生顯著變化的蛋白質(zhì)點(diǎn)38個(gè)，經(jīng)MALDI-TOF-MS/MS質(zhì)譜鑒定，38個(gè)蛋白點(diǎn)被鑒定出37個(gè)，成功率達(dá)到95%以上，但是其中16個(gè)蛋白是功能未知的蛋白質(zhì)，將這些蛋白質(zhì)的氨基酸序列在Broad數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行檢索，找出完整的蛋白序列，并進(jìn)一步在NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行檢索，根據(jù)E-value值找出與其同源性最高的蛋白，推測(cè)其功能．結(jié)果表明，與氰烯菌酯抗性有關(guān)的功能蛋白可以分

10、為代謝相關(guān)蛋白、運(yùn)動(dòng)相關(guān)蛋白、調(diào)控相關(guān)蛋白、細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)相關(guān)蛋白以及其他蛋白．代謝相關(guān)蛋白有丙酮酸脫羧酶、丙酮酸激酶、轉(zhuǎn)氨酶、ACC脫氨酶、組蛋白乙酰轉(zhuǎn)移酶、氨酰-tRNA合成酶和谷氨酰胺合成酶等；運(yùn)動(dòng)相關(guān)蛋白有ARP2/3復(fù)合物和驅(qū)動(dòng)蛋白1；調(diào)控相關(guān)蛋白有真核翻譯起始因子3亞基、真菌特異性轉(zhuǎn)錄因子、線(xiàn)粒體載體蛋白、30KDa熱休克蛋白、熱休克蛋白SSCI、ATP結(jié)合盒轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白亞家族F和LAGLIDADG endonucleasc等；信

11、號(hào)傳導(dǎo)相關(guān)蛋白有GTP綁定核蛋白和腺甘酸環(huán)化酶相關(guān)蛋白．氰烯菌酯對(duì)禾谷鐮孢菌能量代謝系統(tǒng)影響較小而對(duì)氨基酸代謝系統(tǒng)、調(diào)控系統(tǒng)和信號(hào)傳導(dǎo)系統(tǒng)影響較大，由于氰烯菌酯與現(xiàn)有的苯并咪唑類(lèi)、麥角甾醇生物合成抑制劑類(lèi)、甲氧基丙烯酸酯類(lèi)、二硫代氨基甲酸鹽類(lèi)和取代芳烴類(lèi)殺菌劑均無(wú)交互抗性，其作用機(jī)制新穎，而禾谷鐮孢菌對(duì)氰烯菌酯較易產(chǎn)生抗藥性，且大部分抗性菌株都屬于中等抗性水平(MR)或高等抗性水平(HR)，由此可以推測(cè)禾谷鐮孢菌對(duì)氰烯菌酯的抗藥性可能是