禾谷鐮孢菌(Fusarium graminearum)對氰烯菌酯的抗藥性機制研究.pdf

1、氰烯菌酯（2-氰基-3-氨基-3-苯基丙烯酸乙酯，試驗號：JS399-19）是由國家南方農(nóng)藥創(chuàng)制中心江蘇基地最新合成的一種對鐮孢菌具有較高活性的化合物，特別是對禾谷鐮孢菌（Fusarium graminearum）菌絲生長具有強烈的抑制活性，田間也具有良好的防效。但是在離體條件下，通過紫外誘變和藥劑馴化，禾谷鐮孢菌對氰烯茵酯較易產(chǎn)生抗藥性，且大部分抗藥性菌株都屬于中等抗性水平(MR)或高等抗性水平（HR.），抗性菌株的適合度并無明顯下降

2、，禾谷鐮孢菌對氰烯菌酯的室內(nèi)抗藥性具有高等至中等風(fēng)險。在田間出現(xiàn)抗藥性之前研究禾谷鐮孢菌對氰烯茵酯的抗藥性機制，對科學(xué)制定該殺菌劑的應(yīng)用策略和檢測技術(shù)具有重要意義，
　　 本文建立了禾谷鐮孢菌原生質(zhì)體高效遺傳轉(zhuǎn)化技術(shù)平臺．以氰烯菌酯高抗（JS399.19tm）菌株Y2021A為供試菌株，優(yōu)化胞壁降解酶系統(tǒng)和潮霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶基因（hph）轉(zhuǎn)化系統(tǒng)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，制備禾谷鐮孢菌原生質(zhì)體最適宜的條件為每毫升2％Ddslase和2%Snai

3、lase混合酶液中加)x.0.129幼殖體，30℃酶解1.5 h，hph的轉(zhuǎn)化效率可以達到40-50個轉(zhuǎn)化子/ug DNA片段。
　　 利用禾谷鐮孢菌原生質(zhì)體高效遺傳轉(zhuǎn)化技術(shù)平臺，分別將hph和正負篩選標(biāo)記基因（hph-hsv）轉(zhuǎn)化到JS399-19nR菌株Y2021A中，建立隨機插入突變體文庫，并篩選氰烯菌酯敏感性突變體。本研究共獲得hph隨機插入突變體10163個，其中10125個能在loo ug/mL潮霉素B的PSA平板上

4、正常生長，被認定為hph隨機插入陽性突變體，但這些陽性突變體在10 ug/mL氰烯茵酯上均能正常生長，表現(xiàn)出發(fā)菌株所表現(xiàn)的抗藥性；共獲得hph-hsv隨機插入突變體4745個，其中4336個能在loou/mL潮霉素B的PSA平板上正常生長而不能在0.2M的F2du上生長，被認定為hph-hsv隨機插入陽性突變體，在hph-hsv隨機插入陽性突變體中有328個突變體對氰烯菌酯表現(xiàn)敏感，這些突變體被認為是氰烯菌酯敏感性突變體，并被用來研究禾

5、谷鐮孢菌對氰烯菌酯抗藥性相關(guān)基因的材料。
　　 以氰烯菌酯敏感性突變體為研究材料，通過Tail-PCR擴增hph-hsv的側(cè)翼序列，并與Fusarium graminearum基因文庫進行比對，結(jié)果發(fā)現(xiàn)hph-hsv插入在tubulin betachain(FGSG06611.3)（b2-tub）中．經(jīng)PCR、測序、Southern blot和RT-PCR的進一步驗證，hph-hsv不是插入到p2-tub中，而是替換了肪-tub

6、的編碼區(qū)．將不同抗藥性水平茵株與禾谷鐮孢菌野生型菌株2021的32-tub進行比對，發(fā)現(xiàn)其·微管蛋白的12、17、21、22、41和74位氨基酸分別發(fā)生了不同的改變．
　　 通過對禾谷鐮孢菌野生型菌株2021和JS399-19HR菌株JT04.-4的132-tub敲除體/回復(fù)體和JS399-19脹菌株Y2021A的敏感性突變體研究，結(jié)果表明，氰烯菌酯對野生型菌株2021132-tub敲除體和敏感性突變體的生長抑制中濃度ECso值

7、與對野生型菌株2021的ECso值沒有顯著差異，但是最低抑制濃度MIC值下降了4倍。JS399-19tm菌株JT04-42-tub敲除體對氰烯茵酯抗性水平下降，表現(xiàn)中抗．與野生型菌株2021相比，32-tub敲除體和敏感性突變體的菌絲生長速率、產(chǎn)分生孢子能力、產(chǎn)子裳殼能力及致病力均顯著下降，但是敏感性突變體較132-tub敲除體下降的幅度小，不同類型菌株的p2-tub回復(fù)體對氰烯菌酯則表現(xiàn)出與出發(fā)菌株相同的抗藥性水平，其菌絲生長速率、產(chǎn)

8、分生孢子能力、產(chǎn)子囊殼能力及致病力也基本恢復(fù)。本研究結(jié)果表明，fl2-mb基因敲除和hph-hsv插入缺失是禾谷鐮孢菌對氰烯菌酯抗藥性下降和喪失的重要機制．
　　 通過禾谷鐮孢菌蛋白質(zhì)雙向電泳圖譜分析，研究了氰烯菌酯對野生型敏感菌株2021和JS399-19rm菌株Y2021A蛋白質(zhì)組學(xué)的影響．用EC90（0.5ug/mL）濃度的氰烯菌酯處理野生敏感菌株2021和JS399-19HR菌株Y2021A12h，同時以不加藥劑作為對照

9、，獲得敏感菌株經(jīng)藥劑處理以后蛋白質(zhì)表達量發(fā)生顯著變化，而抗藥性菌株未發(fā)生顯著變化的蛋白質(zhì)點38個，經(jīng)MALDI-TOF-MS/MS質(zhì)譜鑒定，38個蛋白點被鑒定出37個，成功率達到95%以上，但是其中16個蛋白是功能未知的蛋白質(zhì)，將這些蛋白質(zhì)的氨基酸序列在Broad數(shù)據(jù)庫中進行檢索，找出完整的蛋白序列，并進一步在NCBI數(shù)據(jù)庫中進行檢索，根據(jù)E-value值找出與其同源性最高的蛋白，推測其功能．結(jié)果表明，與氰烯菌酯抗性有關(guān)的功能蛋白可以分

10、為代謝相關(guān)蛋白、運動相關(guān)蛋白、調(diào)控相關(guān)蛋白、細胞信號傳導(dǎo)相關(guān)蛋白以及其他蛋白．代謝相關(guān)蛋白有丙酮酸脫羧酶、丙酮酸激酶、轉(zhuǎn)氨酶、ACC脫氨酶、組蛋白乙酰轉(zhuǎn)移酶、氨酰-tRNA合成酶和谷氨酰胺合成酶等；運動相關(guān)蛋白有ARP2/3復(fù)合物和驅(qū)動蛋白1；調(diào)控相關(guān)蛋白有真核翻譯起始因子3亞基、真菌特異性轉(zhuǎn)錄因子、線粒體載體蛋白、30KDa熱休克蛋白、熱休克蛋白SSCI、ATP結(jié)合盒轉(zhuǎn)運蛋白亞家族F和LAGLIDADG endonucleasc等；信

11、號傳導(dǎo)相關(guān)蛋白有GTP綁定核蛋白和腺甘酸環(huán)化酶相關(guān)蛋白．氰烯菌酯對禾谷鐮孢菌能量代謝系統(tǒng)影響較小而對氨基酸代謝系統(tǒng)、調(diào)控系統(tǒng)和信號傳導(dǎo)系統(tǒng)影響較大，由于氰烯菌酯與現(xiàn)有的苯并咪唑類、麥角甾醇生物合成抑制劑類、甲氧基丙烯酸酯類、二硫代氨基甲酸鹽類和取代芳烴類殺菌劑均無交互抗性，其作用機制新穎，而禾谷鐮孢菌對氰烯菌酯較易產(chǎn)生抗藥性，且大部分抗性菌株都屬于中等抗性水平(MR)或高等抗性水平(HR)，由此可以推測禾谷鐮孢菌對氰烯菌酯的抗藥性可能是