新型殺菌劑氰烯菌酯對(duì)禾谷鐮孢菌(Fusarium graminearum)的作用方式及抗藥性遺傳研究.pdf

1、氰烯菌酯(2一氰基一3一氨基-3-苯基丙烯酸乙酯，試驗(yàn)號(hào)：JS399-19)是由國(guó)家南方農(nóng)藥創(chuàng)制中心江蘇基地最新合成的一種對(duì)鐮孢菌具有較高活性的化合物，特別是對(duì)禾谷鐮孢菌（Fusarium graminearum）菌絲生長(zhǎng)具有強(qiáng)烈的抑制活性，顯示了該化合物具有防治麥類赤霉病的應(yīng)用前景。在新型殺菌劑進(jìn)入市場(chǎng)之前研究其作用方式及抗藥性遺傳，對(duì)科學(xué)制定該殺菌劑的開發(fā)和應(yīng)用策略具有重要意義。
　　 離體條件下，采用菌絲生長(zhǎng)測(cè)定法測(cè)定該藥

2、劑對(duì)禾谷鐮孢菌抗性菌株和敏感菌株的生長(zhǎng)抑制活性；同時(shí)采用孢子萌芽測(cè)定法測(cè)定了其對(duì)禾谷鐮孢菌分生孢子萌芽的影響。結(jié)果表明，氰烯菌酯能夠強(qiáng)烈地抑制禾谷鐮孢菌敏感菌株菌絲的生長(zhǎng)，EC50值分布在0.092～0.141μg/mL之間；并可降低敏感菌株分生孢子的萌發(fā)速率，以及影響其萌發(fā)的方式，使芽管從分生孢子基部和中間細(xì)胞萌發(fā)的比率增加；同時(shí)氰烯菌酯使敏感菌株分生孢子膨大畸形，并使其芽管腫脹、扭曲，明顯抑制其芽管的伸長(zhǎng)生長(zhǎng)，但對(duì)抗性菌株的抑制作用

3、和致畸作用不明顯。氰烯菌酯對(duì)禾谷鐮孢菌菌體呼吸的抑制作用較弱，同時(shí)也幾乎不影響菌體丙酮酸的合成量，說明該藥劑很可能不直接作用于禾谷鐮孢菌的呼吸代謝。
　　 將3個(gè)抗氰烯菌酯的禾谷鐮孢菌（Fusarium graminearum Schw.）菌株分別在含氯酸鹽的MMC培養(yǎng)基上培養(yǎng)，共獲得了50個(gè)硝酸鹽利用缺陷突變體(nit)。比較了抗性菌株的nit突變體與親本在無性和有性階段的主要生物學(xué)性狀?？剐跃甑膎it突變體與親本在菌落生長(zhǎng)

4、速率、培養(yǎng)性狀和致病性方面沒有顯著差異；但某些突變體中，產(chǎn)孢量和產(chǎn)子囊殼能力方面存在一定差異。此外，禾谷鐮孢菌對(duì)氯酸鹽和氰烯菌酯之間沒有交互抗藥性，且抗性可以穩(wěn)定遺傳。因此，可以將nit作為遺傳標(biāo)記來研究禾谷鐮孢菌對(duì)氰烯菌酯的抗藥性遺傳學(xué)。
　　 離體條件下，通過紫外光誘變和藥劑馴化從5個(gè)野生敏感的親本菌株中共獲得了86個(gè)對(duì)氰烯菌酯的抗性菌株，紫外光誘變產(chǎn)生抗性的頻率在1.25×10-7-2.29×10-7之間，而通過藥劑馴化產(chǎn)

5、生抗性的頻率在2.5-6.0％之間，說明發(fā)生抗性的頻率偏高，且大部分抗性菌株都屬于中等抗性水平(MR)或高等抗性水平(HR)。雖然禾谷鐮孢菌對(duì)氰烯菌酯發(fā)生抗藥性以后，不會(huì)改變其營(yíng)養(yǎng)親和能力，但是抗藥性基因不能通過菌絲融合傳遞給另一個(gè)菌株或發(fā)生的概率極低，這將不利于對(duì)氰烯菌酯的抗性群體的發(fā)展。因此，菌絲融合在禾谷鐮孢菌對(duì)氰烯菌酯的抗藥性群體發(fā)展中的作用較小，
　　 選擇了43個(gè)單孢分離的田間野生敏感菌株和45個(gè)實(shí)驗(yàn)室誘導(dǎo)的對(duì)氰烯菌

6、酯的抗性菌株，測(cè)定這些菌株對(duì)氰烯菌酯的敏感性，將其劃分為敏感(S)、中抗(MR)和高抗(HR)3個(gè)水平（根據(jù)其對(duì)氰烯菌酯的敏感性）。所選的3個(gè)禾谷鐮孢菌(2043，Y2021B和YNT,分別代表S,MR和HR)對(duì)氰烯菌酯的敏感性在自交和無性繁殖過程中可以穩(wěn)定遺傳。從這些菌株中，隨機(jī)選取8個(gè)代表這三個(gè)敏感性水平的菌株用于抗藥性的遺傳研究（F1代法）。并以硝酸鹽營(yíng)養(yǎng)缺陷型突變體（nit）作為遺傳標(biāo)記，來確認(rèn)來自雜交的單個(gè)子囊殼。按照S×S、

7、S×HR、MR×HR、HR×HR、MR×S等共設(shè)計(jì)了6個(gè)雜交組合，對(duì)各雜交后代對(duì)氰烯菌酯的敏感性測(cè)定發(fā)現(xiàn)，S×HR、MR×HR和MR×S的雜交后代出現(xiàn)了1:1的分離比例。在雜交組合S×S和HR×HR的后代中均未出現(xiàn)除雙親表現(xiàn)型以外的重組性個(gè)體（即未出現(xiàn)抗性水平的分離）。因此，筆者認(rèn)為，禾谷鐮孢菌對(duì)氰烯菌酯的抗藥性是由單個(gè)基因控制的，該基因的不同突變類型很可能導(dǎo)致不同水平的抗藥性（MR和HR），抗藥性不受修飾基因或細(xì)胞質(zhì)遺傳因子的影響。<

8、br>　　 以硝酸鹽營(yíng)養(yǎng)缺陷型突變體(nit)和多菌靈抗性為遺傳標(biāo)記，在6個(gè)所選菌株中設(shè)計(jì)了3個(gè)禾谷鐮孢菌(Furarium graminearum)的室內(nèi)雜交組合和三個(gè)田間雜交組合，使各菌株之間進(jìn)行雜交，從而研究有性重組。在每個(gè)田間雜交組合的稻樁表面隨機(jī)挑取100個(gè)以上雜交或自交的單個(gè)子囊殼，檢測(cè)結(jié)果表明三個(gè)雜交組合的雜交頻率為5.7-20.9％，從而確認(rèn)了在田間條件下發(fā)生了有性重組。從各雜交組合的后代中任意挑選出3個(gè)有性重組體，比

9、較了這些有性重組體與其親本在無性和有性階段的主要生物學(xué)性狀。結(jié)果表明，禾谷鐮孢菌中的nit基因及對(duì)殺菌劑多菌靈的抗藥性基因可以通過有性雜交的方式重組，即發(fā)生了有性重組。有性重組體與其親本在菌落生長(zhǎng)、培養(yǎng)性狀和致病性方面沒有顯著差異；但某些有性重組體中，產(chǎn)孢量和產(chǎn)子囊殼能力方面存在一定差異。總體看來，有性重組體仍然保持了較高的適合度。因此，可以認(rèn)為有性重組在禾谷鐮孢菌群體對(duì)多菌靈抗藥性發(fā)生發(fā)展以及群體遺傳進(jìn)化中可能起著重要的作用。

10、　　 為了評(píng)估田間對(duì)多菌靈已經(jīng)產(chǎn)生抗藥性的禾谷鐮孢菌對(duì)氰烯菌酯產(chǎn)生抗性的風(fēng)險(xiǎn)，選擇了5個(gè)菌株（對(duì)多菌靈抗性或敏感），并被鑒定為對(duì)多菌靈敏感(S)、中抗(MR)和高抗(HR)，并用來在含10μ,g/mL氰烯菌酯的PSA培養(yǎng)基平板上誘導(dǎo)對(duì)氰烯菌酯的抗藥性.總共獲得了24個(gè)對(duì)氰烯菌酯抗性的突變體這些抗藥性突變體能在PSA培養(yǎng)基平板上轉(zhuǎn)代培養(yǎng)8次后和在4℃冰箱里保存60天后仍然保持著對(duì)氰烯菌酯和（/或）多菌靈的抗藥性?？梢酝茰y(cè)，對(duì)多菌靈的抗藥

11、性和對(duì)氰烯菌酯的抗藥性在兩個(gè)親和菌株的菌絲融合過程中不能發(fā)生抗藥性物質(zhì)的交換，這可能會(huì)在一定程度上能夠延緩田間菌株對(duì)氰烯菌酯產(chǎn)生抗藥性。在某些抗藥性突變體中，菌絲生長(zhǎng)和產(chǎn)孢能力出現(xiàn)下降，說明禾谷鐮孢菌對(duì)氰烯菌酯產(chǎn)生抗藥性突變也可能導(dǎo)致適合度的降低。然而，大多數(shù)突變體都顯示了與其親本相似的有性繁殖能力和致病性。而且，總體看來，大多數(shù)突變體都擁有著與親本相似的適合度。多菌靈和氰烯菌酯的防效試驗(yàn)與室內(nèi)活性測(cè)定的結(jié)果一致。氰烯菌酯對(duì)田間抗多菌靈