大麗輪枝菌蛋白激發(fā)子純化、基因克隆與功能分析.pdf

1、激發(fā)子具有激發(fā)植物防御反應(yīng)、誘導(dǎo)提高植物抗病性的功能。本文從大麗輪枝菌(Verticilliumdahliae)培養(yǎng)液中分離純化出一種蛋白激發(fā)子,該激發(fā)子能引起煙草葉片過敏性反應(yīng),誘導(dǎo)煙草植物防衛(wèi)物質(zhì)的產(chǎn)生和積累；克隆并獲得了激發(fā)子基因,成功實現(xiàn)了在大腸桿菌(Escherichia coli)中的表達與純化,用RT-PCR技術(shù)探究了該基因表達產(chǎn)物誘導(dǎo)煙草抗病相關(guān)基因的表達。本研究為進一步揭示激發(fā)子誘導(dǎo)植物系統(tǒng)獲得性抗性及機制研究奠定了基

2、礎(chǔ)。
　　 1.利用硫酸銨沉淀、(A)KTA explorer10蛋白純化儀、非變性電泳、割膠電洗脫等方法,從大麗輪枝菌(Verticillium dahliae)發(fā)酵液中分離純化出一種蛋白激發(fā)子,經(jīng)SDS-PAGE電泳檢測為單一條帶,相對分子量為17kD,等電點為4.34,命名為PevD1(Protein elicitor from Verticillium dahliae)。該蛋白激發(fā)子能夠誘導(dǎo)煙草的過敏反應(yīng)。
　　

3、 2.蛋白激發(fā)子PevD1能激發(fā)煙草抗病早期信號事件的發(fā)生(葉片H2O2的積累,細胞的活性氧爆發(fā),H2O2產(chǎn)生,胞外質(zhì)的堿化,NO的產(chǎn)生和積累)；引起防御性物質(zhì)(胼胝質(zhì),酚類和木質(zhì)素)的產(chǎn)生和積累。誘導(dǎo)煙草葉片的苯丙氨酸解氨酶(PAL)、多酚氧化酶(PPO)和過氧化物酶(POD)活性提高,PAL活性144h時達到最大,是對照的3.3倍:在處理120h時,PPO的含量最高,增幅達到236.8％;POD活性在誘導(dǎo)120h出現(xiàn)活性高峰,較對照

4、增加204.6.％；同時該激發(fā)子誘導(dǎo)煙草過敏性反應(yīng)過程中,煙草細胞膜通透性增加,細胞發(fā)生程序性死亡,細胞發(fā)生DNA片段化,并且過敏性反應(yīng)標記基因hrs203J,hin1被誘導(dǎo)表達。
　　 3.質(zhì)譜ESI-MS／MS檢測并進行de novo從頭測序,獲得該激發(fā)子蛋白3個可靠的肽段序列,在NCBI中肽段比對后發(fā)現(xiàn),該蛋白激發(fā)子PevD1是黑白輪枝菌(Verticillium albo-atrum)一個假設(shè)蛋白,其功能未知。設(shè)計特異性

5、引物擴增出pevD1全編碼基因序列468bp,編碼155個氨基酸并且含有一個18氨基酸殘基的信號肽,理論分子量為16.23kD。將pevD1構(gòu)建在pET-28a-c(+)載體上,轉(zhuǎn)入大腸桿菌獲得了重組表達蛋白。
　　 4.PevD1可以誘導(dǎo)煙草獲得系統(tǒng)獲得性抗性(SAR),提高煙草對煙草花葉病毒(TMV)抗性,激發(fā)子誘導(dǎo)煙草植株后6天,枯斑抑制率達到53.85％;枯斑大小抑制率達到32.06％。半定量RT-PCR結(jié)果顯示,激發(fā)子