大麗輪枝菌拮抗細(xì)菌DM-54菌株的分離及抗菌蛋白純化.pdf

1、棉花黃萎病是由大麗輪枝菌（Verticillium dahliae）侵染引起的真菌性維管束系統(tǒng)病害，是棉花最嚴(yán)重的病害之一，給我國(guó)棉花生產(chǎn)造成嚴(yán)重?fù)p失，被稱為“棉花的癌癥”。目前以菌治菌的生物防治被認(rèn)為是一種最具有發(fā)展?jié)摿Φ挠行Х乐畏椒ā?br>　　 本研究從棉花根際土壤中分離到的891株細(xì)菌菌株中篩選出對(duì)大麗輪枝菌的生長(zhǎng)有抑制作用的89株，其中10株拮抗菌株的無菌體發(fā)酵液表現(xiàn)拮抗活性，說明10株拮抗菌株主要是通過產(chǎn)生抗生類物質(zhì)來抑制

2、大麗輪枝菌的生長(zhǎng)，其中DM-54菌株的活性最高。經(jīng)進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn) DM-54菌株所分泌的抗生類物質(zhì)屬于蛋白質(zhì)類。DM-54菌株發(fā)酵液分別對(duì)12種病原菌進(jìn)行抑菌實(shí)驗(yàn)，結(jié)果表明對(duì)其中大麗輪枝（Verticillium dahliae Kleb），膠胞炭疽菌（Colletotrichum gloeosporioides Penz），串珠鐮孢菌（Fusarium moniliforme Sheld），劍蘭炭疽（Glomerella cingul

3、ata）等8種病原菌有較高的拮抗活性，屬較廣抗菌譜的細(xì)菌，生防應(yīng)用前景廣闊。
　　 通過結(jié)合形態(tài)特征、生理生化反應(yīng)及16S rDNA基因序列分析確定DM-54菌株為解淀粉芽孢桿菌（Bacillus amyloliquefaciens）。
　　 對(duì)解淀粉芽孢桿菌B. amyloliquefaciens DM-54菌株產(chǎn)抗菌物質(zhì)的液態(tài)發(fā)酵條件進(jìn)行優(yōu)化，確定DM-54菌株發(fā)酵產(chǎn)抗菌蛋白最適發(fā)酵培養(yǎng)基為：糊精5％，大豆蛋白胨3％

4、，MgSO40.02％，CaCl20.01％，初始pH7.0；250 mL三角瓶裝液量30 mL，種齡16h，接種量10％，搖床轉(zhuǎn)速200 r/min，發(fā)酵溫度32℃，發(fā)酵時(shí)間48 h。優(yōu)化前后蛋白抑菌活性差別明顯，優(yōu)化之前抑菌圈直徑16.3 mm，優(yōu)化后22.8 mm。
　　 芽孢是微生物菌劑的最佳制劑形式，對(duì)惡劣的環(huán)境因素的具有抗性，可延長(zhǎng)制劑保存期，穩(wěn)定活性。對(duì)B.amyloliquefaciens DM-54菌株產(chǎn)芽孢條

5、件進(jìn)一步進(jìn)行摸索，產(chǎn)芽孢最適發(fā)酵培養(yǎng)基為：乳糖0.5％、黃豆餅粉2.0％、MnSO4·H2O0.3％、培養(yǎng)液初始pH值為7.5；種齡18 h、裝液量50 mL/250 mL、接種量10％、發(fā)酵時(shí)間36 h、溫度為30℃、轉(zhuǎn)速為220 r/min。在此優(yōu)化條件下，DM-54菌株發(fā)酵液中的菌體芽孢形成率大大提高，最終生物量達(dá)到2×109個(gè)/mL，芽孢形成率達(dá)到98.3％。
　　 通過盆栽實(shí)驗(yàn)，考察棉花黃萎病拮抗細(xì)菌DM-54菌株在土

6、壤中的定殖情況及在棉花根內(nèi)的定殖情況。本實(shí)驗(yàn)分別對(duì)滅菌土和非滅菌土這兩種土樣進(jìn)行拮抗菌的浸種、全部混土和部分混土三種不同處理進(jìn)行盆栽實(shí)驗(yàn)。結(jié)果表明，30d后拮抗細(xì)菌DM-54菌株能夠在滅菌土和非滅菌中定殖，定殖數(shù)量達(dá)106 cfu/g土左右，經(jīng)過30 d后并保持較高的抑菌活性，并且菌株在滅菌土中的定殖數(shù)量高于非滅菌土中的數(shù)量。施用方法中以其中全部混土情況下定殖能力最強(qiáng)。通過對(duì)棉苗根內(nèi)細(xì)菌的回收，證實(shí)拮抗細(xì)菌DM-54能在棉花根內(nèi)定殖，定