利用模式植物擬南芥鑒定和分離大麗輪枝菌外泌毒素中的致萎活性因子.pdf

1、黃萎病是一種世界性病害，其寄主范圍廣，作用機(jī)理復(fù)雜，致病途徑多樣，難于防治，己成為嚴(yán)重影響以棉花為主的多種重要經(jīng)濟(jì)作物的產(chǎn)量與品質(zhì)的重要真菌性病害。由于棉花等作物遺傳背景復(fù)雜，很難在分子水平進(jìn)行更深入的研究，另外黃萎病菌(大麗輪枝菌)小種分化變異性強(qiáng)等原因也為抗病遺傳育種帶來(lái)重重困難。建立擬南芥與大麗輪枝菌互作的模型，可以充分利用擬南芥這一模式植物的各種優(yōu)勢(shì)，促進(jìn)病原菌與寄主植物互作的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)分子機(jī)制研究。已有的研究表明，黃萎病菌分泌的

2、致萎毒素是導(dǎo)致寄主植物萎蔫的主要原因，而且毒素成分極為復(fù)雜。研究黃萎病菌分泌的致萎毒素的有效成分，獲得擬南芥與病原微生物互作信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的詳細(xì)信息，對(duì)全面了解抗病和感病反應(yīng)機(jī)理、從而控制黃萎病的發(fā)生具有重要意義。 本論文研究工作的主要目的是利用擬南芥和大麗輪枝菌互作研究系統(tǒng)鑒定和分離病原菌分泌毒素中的活性致萎因子，以期為進(jìn)一步鑒定克隆與活性致萎因子互作的寄主基因。論文實(shí)驗(yàn)工作主要是利用液相色譜和質(zhì)譜等技術(shù)對(duì)黃萎病菌培養(yǎng)物外泌毒素進(jìn)行

3、分步深度純化，通過(guò)接種擬南芥進(jìn)行性狀觀察而檢測(cè)各分離組分致萎活性。黃萎病菌液體培養(yǎng)的粗毒素經(jīng)凝膠柱層析，得到2個(gè)有紫外吸收(OD280)的組分(P1和P2)。對(duì)這2個(gè)組分以及峰間無(wú)紫外吸收部分的致萎活性分析表明，其中P2組分具有明顯的致萎活性。利用P2組分針刺成苗葉片或加入培養(yǎng)基對(duì)幼苗處理，結(jié)果均誘發(fā)與粗毒素處理一致的癥狀，使成苗葉片產(chǎn)生過(guò)敏性壞死斑點(diǎn)或抑制幼苗生長(zhǎng)、使幼苗白化。針刺葉片實(shí)驗(yàn)還表明，P2組分處理誘導(dǎo)擬南芥病程相關(guān)蛋白PR

4、1基因的表達(dá)，作為水楊酸信號(hào)途徑的標(biāo)記基因，PR1表達(dá)量在處理48小時(shí)達(dá)到最大。這說(shuō)明P2具有外源激發(fā)子的作用，誘導(dǎo)擬南芥產(chǎn)生抗性。根據(jù)層析保留時(shí)間初步判定P2組分是小分子物質(zhì)的混合物。利用離子交換色譜(IEX)對(duì)P2組分進(jìn)一步分離純化得到5個(gè)組分(D1～D5)，其中D1組分的致萎活性明顯強(qiáng)于其它組分。利用高效液相色譜(HPLC)對(duì)D1分析，得到一個(gè)有致萎活性的組分H112，對(duì)H112組分的質(zhì)譜分析結(jié)果表明其小分子物質(zhì)，化學(xué)分析表明可能