大麗輪枝菌對棉花的侵染及其轉(zhuǎn)錄組和磷酸蛋白質(zhì)組學(xué)分析.pdf

1、棉花黃萎病是危害棉花最嚴(yán)重的病害之一，目前尚無有效的化學(xué)防治手段，選育抗病品種是解決棉花黃萎病最經(jīng)濟(jì)有效的途徑。棉花抗黃萎病鑒定是黃萎病抗性遺傳研究和育種抗病材料篩選最關(guān)鍵的環(huán)節(jié)。然而經(jīng)典的棉花黃萎病抗性鑒定方法建立在對棉花根系造成人為創(chuàng)傷后，使病原菌快速侵入維管束的基礎(chǔ)之上，鑒定結(jié)果受創(chuàng)傷程度，發(fā)病條件、環(huán)境因素以及操作過程等影響較大，棉花發(fā)病不一致，容易產(chǎn)生假抗性，影響鑒定結(jié)果的準(zhǔn)確性。而且傳統(tǒng)的棉花黃萎病抗性鑒定需在黃萎病癥狀出現(xiàn)

2、后才能進(jìn)行，不能觀測黃萎病病癥出現(xiàn)前病原菌的侵入和擴(kuò)展進(jìn)程。黃萎病抗性的遺傳和分子機(jī)制尚不明確，加之陸地棉抗黃萎病抗病種質(zhì)匱乏，棉花抗黃萎病品種選育進(jìn)展緩慢。本研究首先以具有不同抗病性的陸地棉TM-1及海島棉7124為植物材料，采用轉(zhuǎn)GFP基因的大麗輪枝菌培養(yǎng)基定量接種方法，研究大麗輪技菌的侵染機(jī)制和進(jìn)程以及棉花黃萎病抗性的快速、精準(zhǔn)鑒定方法，在此基礎(chǔ)上，通過棉花受大麗輪枝菌侵染后的轉(zhuǎn)錄組及磷酸蛋白質(zhì)紐學(xué)研究，分析受黃萎病侵染過程中棉花

3、基因表達(dá)及蛋白質(zhì)翻譯后磷酸化修飾的變化，為鑒定大麗輪枝菌侵染早期棉花抗（感）病關(guān)鍵基因和關(guān)鍵磷酸化蛋白質(zhì)（位點(diǎn)），解析棉花感染大麗輪枝菌的分子機(jī)制提供新的線索。主要研究結(jié)果如下:
　　1、將轉(zhuǎn)GFP基因的大麗輪枝菌與培養(yǎng)基定量接種相結(jié)合，可以準(zhǔn)確鑒定棉花黃萎病發(fā)病過程及其抗性。以轉(zhuǎn)GFP基因的大麗輪枝菌Vd991-GFP-2為病原菌，分別接種耐黃萎病的海島棉海7124和感病品種TM-1，分析大麗輪枝菌GFP熒光在棉花組織中的定殖分

4、布狀態(tài)和棉花發(fā)病情況，發(fā)現(xiàn)海7124體內(nèi)各部分的GFP熒光強(qiáng)度遠(yuǎn)低于TM-1，侵染6d后，TM-1根、莖和葉片中均檢測到GFP熒光，而海7124僅在根中可以檢測到GFP熒光，且海7124病指顯著低于TM-1，說明海7124對大麗輪枝菌具有一定的抗入侵和較強(qiáng)的抗擴(kuò)展能力。
　　2、通過RNA-seq轉(zhuǎn)錄組測序比較接種與未接種大麗輪枝菌的陸地棉TM-1根莖的轉(zhuǎn)錄水平差異，獲得了935個(gè)差異表達(dá)基因，其中651個(gè)基因受大麗輪枝菌上調(diào)表達(dá)

5、，284基因下調(diào)表達(dá)。差異表達(dá)基因富集分析結(jié)果顯示大麗輪枝菌可以誘導(dǎo)苯丙氨酸代謝途徑增強(qiáng)、木質(zhì)素累積;WRKY、MYB轉(zhuǎn)錄因子、細(xì)胞色素P450、E3泛素連接酶等基因上調(diào)表達(dá)，這些基因可能在棉花相應(yīng)抗黃萎病脅迫激發(fā)棉花的抗性機(jī)制起重要作用。為進(jìn)一步揭示棉花抗黃萎病分子機(jī)制提供了候選基因。
　　3、優(yōu)化建立了適宜于棉花磷酸化蛋白質(zhì)提取和富集方法。比較分析了兩種不同蛋白質(zhì)提取和酶切方法、三種磷酸肽富集方法、不同總蛋白量起始量以及親和色

6、譜過程中添加不同修飾性羥酸等不同因素對于磷酸肽富集數(shù)量和專一性的影響。結(jié)果表明，超濾輔助制備肽段樣品(FASP)蛋白質(zhì)提取方法，以TiO2為基質(zhì)的固相金屬離子親和色譜法，富集得到的磷酸肽數(shù)目最多;孵育過程中，乳酸的加入可以提高TiO2的富集效率和特異性，在一定的范圍內(nèi)，富集到的磷酸肽數(shù)量與蛋白起始量成正比。
　　4、采用上述優(yōu)化的棉花磷酸化蛋白質(zhì)富集方法，結(jié)合無標(biāo)記(Label-free)定量方法，定性及定量的分析了接種大麗輪枝菌