藥用植物（黃精和黃芪）內(nèi)生菌的分離鑒定及胞外多糖結(jié)構(gòu)和生物活性的研究.pdf

1、藥用植物資源因其獨(dú)特的生物學(xué)性質(zhì)及豐富性，常用于人類和動(dòng)物疾病的治療，在醫(yī)療衛(wèi)生保健方面發(fā)揮著非常重要的功能。有文獻(xiàn)報(bào)道，藥用植物中的中藥多糖在其生物學(xué)活性方面發(fā)揮著十分顯著的作用。從藥用植物組織和器官來源的內(nèi)生菌，它們作為非常豐富的細(xì)菌類群，通常與藥用宿主植物存在共生或共棲的關(guān)系。其能夠合成同宿主植物本身相似或相同的一些代謝物。因此，從藥用植物中分離純化內(nèi)生菌，研究其分泌的胞外多糖與宿主（藥用植物）多糖的結(jié)構(gòu)組成和功能差異是本論文研究

2、的重點(diǎn)。
　　黃精多糖和黃芪多糖本身具有獨(dú)特的生物學(xué)特性。本文對(duì)黃芪的根和黃精的根狀莖進(jìn)行內(nèi)生菌分離鑒定，并在此基礎(chǔ)上分離純化出藥用植物內(nèi)生菌中產(chǎn)胞外多糖糖含量高的胞外多糖，并測(cè)定其結(jié)構(gòu)性質(zhì)和生物特性。通過對(duì)藥用植物的多糖與內(nèi)生菌的胞外多糖在結(jié)構(gòu)和生物學(xué)特性方面的比較，發(fā)現(xiàn)內(nèi)生菌胞外多糖與其宿主植物多糖在結(jié)構(gòu)和單糖組成上具有差異性，但具有許多相似的生物活性。
　　本論文分為三部分內(nèi)容。第一部分是藥用植物黃精和黃芪內(nèi)生菌的分離

3、、篩選及鑒定（第二章）;第二部分是藥用植物黃精內(nèi)生菌B3和黃芪內(nèi)生菌Z7胞外多糖的分離純化及性質(zhì)的研究（第三章）;第三部分是藥用植物多糖和內(nèi)生菌胞外多糖生物活性的研究（第四章）。
　　第一部分:
　　首先，采用組織分離法從黃精和黃芪的塊根中共分離出17株內(nèi)生菌，并對(duì)內(nèi)生菌的菌落形態(tài)特征進(jìn)行鑒定。然后對(duì)17株藥用植物內(nèi)生菌的生理生化和16SrDNA測(cè)序分析。結(jié)果顯示，黃精內(nèi)生菌A2、A3為腸桿菌屬;黃精內(nèi)生菌A1、B1、B2、

4、B2為芽孢桿菌屬;黃芪內(nèi)生菌Z1、Z2、Z3、Z4、Z6、M1、M2、M3為芽孢桿菌屬;黃芪內(nèi)生菌Z5和M4為葡萄球菌屬;黃芪內(nèi)生菌Z7為節(jié)細(xì)菌屬。從藥用植物中分離到的內(nèi)生菌大多數(shù)為芽孢桿菌屬。對(duì)其抗菌活性進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果顯示，黃精內(nèi)生菌B3的發(fā)酵處理液對(duì)三種指示菌有較弱的抑制作用。黃芪內(nèi)生菌M1和M2對(duì)大腸桿菌有較弱的抑制作用。黃芪內(nèi)生菌Z1、Z2、Z3、Z5、Z7、M1和M3對(duì)枯草芽孢桿菌有較弱的抑制作用，其中黃芪內(nèi)生菌M1的抑制作用

5、最強(qiáng)。黃芪內(nèi)生菌Z6、M2和M4對(duì)金黃色葡萄球菌有較弱的抑制作用。最后對(duì)17株藥用植物內(nèi)生菌產(chǎn)胞外多糖的測(cè)定，結(jié)果顯示，17株內(nèi)生菌均能夠產(chǎn)生胞外多糖，而黃精內(nèi)生菌B3和黃芪內(nèi)生菌Z7產(chǎn)生的胞外多糖總糖含量最高。綜合以上分析，本實(shí)驗(yàn)選擇菌株B3和Z7作為后續(xù)的研究對(duì)象。
　　第二部分:
　　首先，通過除蛋白、脫色和層析對(duì)黃精內(nèi)生菌EPS-B3和黃芪內(nèi)生菌EPS-Z7分離純化。然后，通過十八角度及光光散射儀測(cè)定多糖的分子量。結(jié)

6、果顯示，黃精內(nèi)生菌EPS-B3的分子量為1.863×104Da;黃精多糖(PSP)的分子量為2.791×104Da;黃芪內(nèi)生菌EPS-Z7的分子量為5.001×104Da;黃芪多糖(APS)的分子量為6.004×105Da。采用離子色譜測(cè)定多糖的單糖組分，結(jié)果顯示，黃精內(nèi)生菌EPS-B3和黃芪內(nèi)生菌EPS-Z7主要有Gal、Glc和Man三種單糖組成;黃精多糖主要有Fru、Rha、Gal、Glc、Man和Fru六種單糖組成;黃芪多糖主要

7、的單糖組分包含F(xiàn)ru、Rha、Gal和Glc。黃精內(nèi)生菌EPS-B3與黃精多糖的單糖組分區(qū)別在于Fru、Rha和Fru單糖只存在于黃精多糖中;黃芪內(nèi)生菌EPS-Z7與黃芪多糖的單糖組分區(qū)別在于黃芪多糖中含有Fru和Rha單糖，而黃芪內(nèi)生菌EPS-Z7中含有Man。同時(shí)結(jié)合紅外光譜分析結(jié)果可知，內(nèi)生菌胞外多糖與其宿主植物多糖在結(jié)構(gòu)和單糖組成上具有差異性，宿主植物多糖可能來源于植物本身產(chǎn)生。
　　第三部分:
　　首先抑菌能力的測(cè)

8、定結(jié)果顯示，分離的藥用植物多糖與藥用植物內(nèi)生菌胞外多糖均沒有抑菌活性。其次抗氧化的測(cè)定結(jié)果顯示，黃精多糖和黃精內(nèi)生菌EPS-B3相比其DPPH的清除能力接近，黃芪多糖和黃芪內(nèi)生菌EPS-Z7相比清除能力也接近。黃精多糖和黃精內(nèi)生菌EPS-B3相比其超氧陰離子的清除能力接近，黃芪多糖和黃芪內(nèi)生菌EPS-Z7的清除能力也接近。黃精內(nèi)生菌EPS-B3的還原能力高于黃精多糖的還原能力，黃芪內(nèi)生菌EPS-Z7的還原能力高于黃芪多糖的能力。黃精多糖

9、對(duì)羥基的清除能力高于黃精內(nèi)生菌EPS-B3的清除能力，而黃芪多糖與黃芪內(nèi)生菌EPS-Z7的清除能力相近。最后是體內(nèi)抗腫瘤的測(cè)定結(jié)果顯示，黃精多糖、黃芪多糖、黃精內(nèi)生菌EPS-B3和黃芪內(nèi)生菌EPS-Z7與PBS組相比，抑制腫瘤的活性顯著。體外抗腫瘤的結(jié)果顯示，黃精多糖PSP的體外抗腫瘤活性高于黃精內(nèi)生菌EPS-B3的體外抗腫瘤活性，而黃芪多糖APS體外抗腫瘤能力低于黃芪內(nèi)生菌EPS-Z7的體外抗腫瘤能力?？苟嗵莑gG的抗體滴度測(cè)定結(jié)果顯