幾種多糖的分離純化、結構解析和生物活性研究.pdf

1、我國有豐富的中草藥資源和微生物資源，以它們?yōu)檠芯坎牧?，分離出免疫活性高、療效明確的多糖，繼而進行化學結構和生物活性研究，一方面可以豐富已有的糖數(shù)據庫，推動糖化學和糖生物學的發(fā)展，另一方面也可為創(chuàng)制具有我國特色的多糖藥物奠定基礎，因而具有較大意義。 柘樹(Cudrania tricuspidata(Carr.)Bur.)為?？畦蠈僦参铮瑥V泛分布于我國華東、中南、西南至河北南部。柘樹根可治療風濕關節(jié)疼痛、黃疸、淋濁、閉經、跌打損傷以

2、及疔瘡癰腫等癥，是一種傳統(tǒng)的中藥材。柘樹根具有提高機體免疫功能、抗氧化、抗炎等多方面的藥理作用，其已知的化學成分主要有氧雜葸酮、黃酮、異黃酮、二苯酮、多糖類等。國內外對柘樹根多糖的報道很少，并且所用多糖樣品為未經純化的粗多糖，所以無法全面了解柘樹根中多糖的類型、含量及它們與柘樹根藥理作用的關系。本文對柘樹根中的多糖組分進行了深入的分離、純化，并對獲得的均-多糖進行化學結構研究和生物活性測定。 從柘樹根中用熱水提取得到一種粗多糖C

3、PS，使用DEAE-纖維素柱層析和多種凝膠過濾柱層析進行分離、純化，獲得了CPS-OA、CPS-1A、CPS-2B、CPS-3A四種均一的多糖組分。應用HPLC、糖基組成分析、甲基化分析、元素分析、GC、GC-MS、部分酸水解、酶水解等化學及生化方法和IR、UV、<'13>C NMR、<'1>H NMR、HMQC、HMBC等光譜學方法對它們的化學結構及理化性質進行了研究，確定了其化學結構或結構特征： ①CPS-OA為α構型的葡聚

4、糖。其主鏈由1，4-連接的葡聚糖組成，分支點位于6位，側鏈內部由1，4-連接的葡萄糖殘基組成，通過1→6糖苷鍵取代于分支點的O-6上，其結構式為： ②CPS-1A主要以α-1，4-D-Glc為主鏈，術端糖基為Gal、Glc和Ara，葡萄糖和半乳糖上含有少量的分支，且含有少量的木糖。 ③CPS-2B的主要部分是一個RG-Ⅰ型的果膠多糖，在主鏈鼠李糖的4位有復雜的Ⅱ型阿拉伯半乳糖支鏈，AG支鏈本身又呈分支結構，以1，3-連接

5、的β-D-半乳聚糖為主鏈，在部分主鏈殘基的6位有非還原木端、1，5-、1，3，5-連接的阿拉伯糖及1，6-連接的半乳糖構成的進一步分支。 ④CPS-3A由1，6-連接的β-D-Gal，1，4-連接的β-D-Gal，1，4-連接的β-D-GalA，1，3，6-連接的β-D-Gal，1，2，4-連接的β-L-Rha構成，在1，2，4-連接的β-L-Rha的0-2或0-4位和1，3，6．連接的β-D-Gal的0-3位形成分支點，并以1

6、-連接的Gal為末端。側鏈由1-連接的Ara和1，5-連接的Ara和1，3，5-連接的Ara組成，并連接在主鏈的1，6-連接的β-D-Gal的0-3位。 以上4種多糖組分均為首次從柘樹中發(fā)現(xiàn)。 牛蒡(Arctium lappa L．)是菊科牛蒡屬直根系二年生大型草本植物，具有良好的醫(yī)療保健作用和獨特的綜合營養(yǎng)價值。牛蒡的肉質根富含蛋白質、氨基酸、多種維生素、礦物質以及菊科(Compositae)植物特有的菊糖。從牛蒡根中

7、用熱水提取得到一種粗多糖，使用凝膠過濾柱層析得到一種均一的低聚糖組分ALO。采用HPLC、糖基組成分析、甲基化分析、GC、GC．MS、NMR(1D，2D)、UV、IR等對該牛蒡低聚糖的化學結構進行深入研究，確定它是一種菊糖型的低聚果糖，由13個呋喃型的果糖以β(2→1)糖苷鍵相連，1個吡喃型的葡萄糖以α(1→2)糖苷鍵連接在果糖末端的線性直鏈結構，結構式為：β-D-Fruf-(2[→1)-β-D-Fruf-(2]<,n>→1-α-D-G

8、lop n=12擬康氏木霉(Trichodermapseudokoningii)是本實驗室分離到的一株對多種病原菌有較強拮抗作用的生防菌株，已經證明該菌發(fā)酵時分泌到胞外的多糖類物質，可使番茄幼苗灰霉病的發(fā)病率明顯降低，與植物系統(tǒng)抗性相關酶的活性顯著升高。用離子交換層析和凝膠過濾層析對擬康氏木霉的胞外多糖組分進行了分離、純化，得到一個均一多糖組分TPP-0，對其理化性質和化學結構進行了初步分析。TPP-0主要由鼠李糖和葡萄糖醛酸組成，二者

9、的摩爾比為1.6:1.0，<'13>C NMR譜中顯示有9個異頭碳信號，提示這2種組分有多種連接方式，詳細結構情況正在研究。 用MTS-PMS方法研究了4種柘樹根多糖(CPS-OA、CPS-1A、CPS-2B、CPS-3A)在體外直接及協(xié)同有絲分裂原ConA或LPS對小鼠脾淋巴細胞增殖的影響，用中性紅比色法測定了4種柘樹根多糖對腹腔巨噬細胞(Mφ)吞噬功能的影響，并與應用于臨床的香菇多糖(LNT)進行了比較。結果表明：

10、在6．25～100 μg/mL濃度范圍內，CPS-1A、CPS-2B、CPS-3A可直接刺激小鼠脾淋巴細胞增殖，與空白對照相比均達到極顯著性差異。CPS-1A在濃度為50 μg/mL、100 μg/mL時刺激效果高于最佳濃度的LNT(25 μg/mL)，且達到極顯著性差異；CPS-2B在濃度為50 μg/mL和100 μg/mL時刺激效果高于LNT，且達到極顯著性差異；CPS-3A在濃度為25 μg/mL、50 μg/mL、100μg/

11、mL時刺激效果高于LNT，且達到極顯著性差異。 在6.25～100 μg/mL濃度范圍內，CPS-1A、CPS-2B、CPS-3A協(xié)同有絲分裂原ConA可顯著促進小鼠脾淋巴細胞的增殖，與空白對照相比均達到極顯著性差異。CPS-1A在濃度為50 μg/mL時刺激效果高于LNT，且達到極顯著性差異；CPS-2B在濃度為25 μg/mL、50 μg/mL時刺激效果高于LNT，且25 μg/mL達到顯著性差異，50 μg/mL達到極顯著

12、性差異；CPS-3A在濃度為12.5μg/mL時刺激效果高于LNT，達到顯著性差異，且作用濃度小于LNT。 在協(xié)同有絲分裂原LPS對小鼠脾淋巴細胞增殖的影響中，CPS-1A在濃度為50μg/mL、100μg/mL時與空白對照相比達到極顯著性差異，且刺激效果高于LNT，50 μg/mL達到顯著性差異，100μg/mL達到極顯著性差異；CPS-2B在6.25～100μg/mL濃度范圍內與空白對照相比均達到極顯著性差異，6.25μg/

13、mL、50μg/mL、100μg/mL刺激效果高于LNT，達到顯著性差異，且6.25 μg/mL作用濃度小于LNT；CPS．3A在濃度為12.5μg/mL時與空白對照相比達到顯著性差異，在濃度為6.25 μg/mL、25 μg/mL、50 μg/mL和100 μg/mL時與空白對照相比均達到極顯著性差異，25 μg/mL刺激效果高于LNT，達到顯著性差異。 CPS-1A、CPS-2B在一定濃度范圍內可顯著增強小鼠腹腔巨噬細胞吞噬

14、中性紅的能力。CPS-1A在100 μg/mL與空白對照相比達到顯著性差異，50μg/mL與空白對照相比達到極顯著性差異，在50 μg/mL與最佳濃度(50 μg/mL)的LNT作用效果相同；CPS-2B在100μg/mL與空白對照相比達到顯著性差異，與LNT作用效果無顯著性差異；CPS-3A在此范圍內無明顯作用。 CPS-OA在上述實驗中均未表現(xiàn)出活性。CPS-1A、CPS-2B、CPS-3A可能是一種活性高于LNT的免疫增強