栗疫菌蛋白激發(fā)子PECp1基因克隆表達(dá)與功能分析.pdf

1、板栗是四大堅(jiān)果之一，具有重要的經(jīng)濟(jì)價(jià)值和營(yíng)養(yǎng)價(jià)值。板栗在我國(guó)適應(yīng)性強(qiáng)，分布范圍廣泛，具有重要的生態(tài)價(jià)值，也是貧困山區(qū)脫貧致富的重要樹(shù)種。板栗疫病的發(fā)生阻礙了板栗的增收增產(chǎn)，嚴(yán)重時(shí)造成全株死亡。蛋白激發(fā)子能夠引發(fā)植物的免疫反應(yīng)，增強(qiáng)植物的抗逆能力，在植物抗病害過(guò)程中起著重要作用，目前關(guān)于板栗疫病蛋白激發(fā)子的研究還未見(jiàn)報(bào)道。本文以板栗疫病為研究對(duì)象，通過(guò)與已知蛋白激發(fā)子進(jìn)行同源性比對(duì)，進(jìn)行栗疫菌蛋白激發(fā)子PECp1(Proteinelici

2、tor of Cryphonectria parasitica1)片段的克隆，并進(jìn)行原核表達(dá)，優(yōu)化其表達(dá)條件，并將表達(dá)出的蛋白作用于植物種子和幼苗，分析了栗疫菌蛋白激發(fā)子的結(jié)構(gòu)，同時(shí)也為深入研究該蛋白的功能奠定了理論基礎(chǔ)，本研究取得的主要成果如下:
　　1.栗疫菌蛋白激發(fā)子PECp1的基因克隆:通過(guò)與已知的蛋白激發(fā)子進(jìn)行同源性比對(duì)，采用同源克隆，擴(kuò)增出PECp1的DNA片段，通過(guò)RT-PCR擴(kuò)增出PECp1的cDNA片段，將DNA

3、和cDNA序列進(jìn)行比對(duì)，PECp1的DNA全長(zhǎng)824bp，包含兩段總長(zhǎng)為204bp的內(nèi)含子，PECp1的cDNA全長(zhǎng)618bp，共編碼205個(gè)氨基酸，含有一個(gè)完整的閱讀框。
　　2.栗疫菌蛋白激發(fā)子PECp1的生物信息學(xué)分析:采用DNA MAN、protaram、SOPMA等生物信息學(xué)分析軟件分析PECp1的理化性質(zhì)和二級(jí)結(jié)構(gòu)，結(jié)果表明，PECp1蛋白理論分子量為22291.51，等電點(diǎn)pI為4.621，該蛋白為親水性蛋白，并且不

4、穩(wěn)定;同源性分析表明該蛋白N端具有NAC蛋白家族的保守區(qū)，C端具有NAC中UBA的保守區(qū)，同時(shí)與細(xì)極鏈格孢菌激活蛋白PeaT1具有高達(dá)70％的同源性，二級(jí)結(jié)構(gòu)分析表明該蛋白無(wú)跨膜區(qū)，并且沒(méi)有信號(hào)肽位點(diǎn)。
　　3.栗疫菌蛋白激發(fā)子PECp1表達(dá)載體的構(gòu)建和優(yōu)化表達(dá):在引物兩端添加EcoRⅠ和NdeⅠ酶切位點(diǎn)，將栗疫菌蛋白激發(fā)子PECp1連入到表達(dá)載體pET-28a中進(jìn)行原核表達(dá)，可溶性分析表明栗疫菌蛋白激發(fā)子屬于可溶蛋白，采用自動(dòng)誘

5、導(dǎo)和IPTG誘導(dǎo)兩種方法進(jìn)行蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)，結(jié)果表明，自動(dòng)誘導(dǎo)培養(yǎng)基和IPTG兩種方法都?jí)蚰艿玫椒肿恿看笮〖s為40KD的融合蛋白;利用IPTG誘導(dǎo)蛋白表達(dá)時(shí)，IPTG濃度為0.5mM、溫度為30℃、誘導(dǎo)時(shí)間4h時(shí)，可以獲得表達(dá)量較高的蛋白，說(shuō)明采用自動(dòng)誘導(dǎo)培養(yǎng)基可以代替IPTG進(jìn)行大規(guī)模誘導(dǎo)培養(yǎng)。
　　4.栗疫菌蛋白激發(fā)子PECp1的功能分析:采用不同濃度的重組蛋白對(duì)玉米、黃瓜、四季豆浸種后，分別測(cè)定重組蛋白對(duì)植物發(fā)芽、根系生長(zhǎng)和

6、相關(guān)防御酶的影響。結(jié)果表明，不同濃度的重組蛋白對(duì)植物種子的發(fā)芽有不同的促進(jìn)作用，其中對(duì)四季豆的影響最明顯，以稀釋300倍的效果最好，比對(duì)照提高了約70.5％;在根長(zhǎng)方面，該蛋白能夠促進(jìn)黃瓜和玉米根的生長(zhǎng);在幼苗的生長(zhǎng)方面，栗疫菌激發(fā)子能夠促進(jìn)植物幼苗的生長(zhǎng)，但是其作用時(shí)間有一定的限制，6d后黃瓜和四季豆與對(duì)照相比無(wú)顯著差異;在根系活力和防御酶上，栗疫菌激發(fā)子重組蛋白能夠顯著提高玉米的根系活力、POD和CAT活性，與對(duì)照相比差異顯著，根系