表達(dá)基因cel9C的酵母工程菌株構(gòu)建及魔芋紅茶菌發(fā)酵工藝研究.pdf

1、魔芋葡甘露聚糖(Konjac glucomannan，KGM)是一種線形非離子型高分子功能性多糖，具有多種對人體有益的生理功能。但因其分子量大、易溶脹、粘度高、不能消化吸收等缺點，作為功能性食品，直接食用 KGM的營養(yǎng)效果較差。葡甘露低聚糖(Konjac mannoligosaccharides，KMOS)分子量小、粘度低、易于益生菌吸收利用，可采用物理、化學(xué)和生物等方法由KGM制備，有利于KGM營養(yǎng)價值的充分發(fā)揮。紅茶菌是一種傳統(tǒng)的發(fā)

2、酵型酸性茶飲料，具有多種保健作用。目前已有許多關(guān)于紅茶菌發(fā)酵工藝的研究，新風(fēng)味紅茶菌近年來成為研究熱點。紅茶菌與 KMOS結(jié)合可以增加紅茶菌液中寡糖的含量，增強(qiáng)紅茶菌的保健作用，充分發(fā)揮KGM的營養(yǎng)價值。
　　根據(jù)基因cel9C的序列設(shè)計上下游引物，分別引入酶切位點BamH I和Sma I，以質(zhì)粒pET28a-cel9C為模板，PCR擴(kuò)增得到長約2.0 kb的基因cel9C片段。利用基因cel9C片段和載體 pESP-2-2構(gòu)建重

3、組質(zhì)粒 pESP-cel9C，并用重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌(Escherichia coli) TOP10菌株。從重組菌株中提取質(zhì)粒pESP-cel9C，用BamH I和Sma I雙酶切處理，結(jié)果表明質(zhì)粒pESP-cel9C構(gòu)建成功。利用質(zhì)粒pESP-cel9C轉(zhuǎn)化粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)yAS56菌株，在EMM+U選擇性平板上形成12株酵母轉(zhuǎn)化子。剛果紅染色結(jié)果表明，基因cel9C在全部12株酵母

4、轉(zhuǎn)化子中得到有功能活性的表達(dá)；SDS-PAGE結(jié)果顯示，重組β-葡聚糖酶為融合蛋白，其分子量約為99 kDa。DNS法測定酵母轉(zhuǎn)化子胞內(nèi)β-葡聚糖酶活力結(jié)果顯示，10號酵母轉(zhuǎn)化子的胞內(nèi)β-葡聚糖酶活力最高，為169.5 U/mL。將10號酵母轉(zhuǎn)化子命名為S. pombeyAS56(pESP-cel9C)工程菌株，并用其研究魔芋紅茶菌的發(fā)酵工藝。
　　漢遜氏葡糖酸醋桿菌(Gluconacetobacter hansenii CGMC

5、C1671)、釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae CGMCC1670)和酵母工程菌株混合接種發(fā)酵紅茶菌，研究紅茶菌發(fā)酵過程中微生物生長及產(chǎn)酸的情況。試驗結(jié)果顯示，混合接種具有良好的紅茶菌發(fā)酵能力，同時發(fā)現(xiàn)在糖茶水培養(yǎng)基中添加魔芋精粉可以促進(jìn)葡糖酸醋桿菌和釀酒酵母細(xì)胞增殖，加快葡糖酸醋桿菌的生長速度，縮短葡糖酸醋桿菌和釀酒酵母的穩(wěn)定期時長，加快紅茶菌液有機(jī)酸的積累速度。
　　利用單因素試驗考察發(fā)酵時間、綠茶濃

6、度、蔗糖濃度、魔芋精粉濃度、接種量、釀酒酵母/酵母工程菌和裝液量等7個因素對紅茶菌液總酸的影響，結(jié)果顯示發(fā)酵時間、茶葉濃度、接種量、裝液量等4個因素對紅茶菌液總酸的影響較大。根據(jù)單因素試驗結(jié)果，確定各因素的最適水平為：發(fā)酵時間96 h、綠茶濃度0.4％、蔗糖濃度6%、魔芋精粉濃度0.2%、接種量10%、釀酒酵母/酵母工程菌=0.5、裝液量100 mL。
　　利用部分因子析因試驗設(shè)計，從7個因素中篩選出2個影響紅茶菌液總酸的顯著因素