釀酒酵母JJJ1基因敲除提高乙酸耐性和纖維乙醇發(fā)酵性能.pdf

1、木質(zhì)纖維素原料預(yù)處理過(guò)程中會(huì)產(chǎn)生各種對(duì)釀酒酵母(Saccharomycescerevisiae)生長(zhǎng)與發(fā)酵有影響的抑制物，如弱酸、呋喃衍生物和酚類化合物等。乙酸是半纖維素降解產(chǎn)生的一種主要抑制物，未解離的乙酸可以通過(guò)質(zhì)膜簡(jiǎn)單擴(kuò)散進(jìn)入酵母細(xì)胞，引起胞內(nèi)酸化，從而抑制細(xì)胞代謝與生長(zhǎng)，降低纖維乙醇生產(chǎn)效率。因此，釀酒酵母耐乙酸分子機(jī)制的揭示和闡明，對(duì)合理設(shè)計(jì)發(fā)酵條件，指導(dǎo)構(gòu)建適應(yīng)較高濃度乙酸環(huán)境、提高纖維乙醇發(fā)酵效率的釀酒酵母工程菌株均具重要

2、的意義。
　　在課題組前期研究中，發(fā)現(xiàn)當(dāng)酵母細(xì)胞在含有多種抑制物的木質(zhì)纖維素水解液中生長(zhǎng)時(shí)，JJJ1基因的表達(dá)量出現(xiàn)下調(diào)。為了弄清在纖維素水解液中酵母細(xì)胞面對(duì)抑制物時(shí)JJJ1的作用，本文首先對(duì)釀酒酵母菌株BY4741及其基因敲除菌株BY△JJJ1的多種脅迫耐性進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)BY△JJJ1對(duì)甲酸和乙酸的脅迫耐性顯著增強(qiáng)。在5.5g/L乙酸、1.2g/L甲酸或各種抑制物混合的纖維素水解液(3.0g/L乙酸、0.2g/L甲酸、1.1g/

3、L糠醛和0.2g/L5羥甲基糠醛)中，發(fā)酵開(kāi)始和結(jié)束時(shí)間較親株均提前了17h以上。JJJ1敲除對(duì)工業(yè)菌株YJSH1乙酸耐性提高也具有相同的效果。通過(guò)對(duì)乙酸相關(guān)的生理生化因子的分析，發(fā)現(xiàn)乙酸脅迫下，BY JJJ1細(xì)胞內(nèi)的乙酸積累較BY4741減少了7.8％以上，海藻糖增加了37.6％以上;同時(shí)，細(xì)胞膜中長(zhǎng)鏈脂肪酸的比例增加了12.3％，麥角固醇含量減少了12％，細(xì)胞內(nèi)超氧化物歧化酶SOD和過(guò)氧化氫酶CAT活性也有所增加。利用RNA測(cè)序技術(shù)

4、對(duì)野生型菌株BY4741和敲除菌BY△JJJ1的轉(zhuǎn)錄組進(jìn)行分析，結(jié)果顯示在BY△JJJ1菌株中約有218個(gè)基因表達(dá)量發(fā)生了較大變化。對(duì)這些基因在DAVID數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行聚類分析，發(fā)現(xiàn)碳水化合物代謝和細(xì)胞膜上一些轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白相關(guān)基因表達(dá)量下調(diào);同時(shí)，細(xì)胞壁功能和核糖體相關(guān)基因表達(dá)量上調(diào)。結(jié)合兩個(gè)菌株若干生理生化指標(biāo)差異分析，提示JJJ1敲除后，細(xì)胞壁有關(guān)蛋白的表達(dá)量升高，細(xì)胞壁重構(gòu)更加強(qiáng)化，減少了進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)的乙酸量，從而減少了乙酸對(duì)細(xì)胞的毒害作