利用基因工程技術(shù)限制釀酒酵母甘油生物合成提高乙醇發(fā)酵效率.pdf

1、本研究通過(guò)對(duì)釀酒酵母中與乙醇代謝和甘油代謝密切相關(guān)的基因的遺傳操作來(lái)提高釀酒酵母乙醇的產(chǎn)量，降低副產(chǎn)物甘油的產(chǎn)生。主要通過(guò)三條途徑來(lái)研究：(1)缺失編碼甘油由胞內(nèi)向胞外滲透的通道蛋白Fps1p的FPS1，(2)缺失編碼甘油-3-磷酸脫氫酶的GPD1和GPD2，(3)過(guò)量表達(dá)GLN1和GLT1來(lái)解決細(xì)胞內(nèi)還原力問(wèn)題。本文以野生型釀酒酵母菌株DC124為出發(fā)菌株，利用一步基因置換法缺失GPD1和GPD2，利用兩步基因置換法過(guò)量表達(dá)GLN1和

2、GLT1，利用遺傳學(xué)原理通過(guò)不同基因型酵母細(xì)胞的融合及等位基因的分離及遺傳分析得到了對(duì)FPS1，GPD1，GPD2，GLN1，GLT1五個(gè)基因進(jìn)行修飾的各種組合共30株突變菌株。 對(duì)菌株DC124，L-2，ZAL63，ZAL64，ZAL66，ZAL69，ZAL805，ZAL806，ZAL807，ZAL808，ZAL809，ZAL912進(jìn)行發(fā)酵試驗(yàn)。通過(guò)對(duì)試驗(yàn)結(jié)果的分析發(fā)現(xiàn)，與野生型相比，突變株L-2(fps1△∷LEU2),ZA

3、L66(fps1△∷LEU2gpd1△∷URA3)，ZAL69(fps1△∷LEU2gpd2△∷URA3)，ZAL64(gpd1△∷URA3)，ZAL63(gpd2△∷URA3)甘油產(chǎn)量分別降低了17％，23％，51％，17％和46％。突變株ZAL63(gpd2△∷URA3)和ZAL69(gpd2△∷URA3fps1△∷LEU2)的乙醇產(chǎn)量較高。突變株ZAL806(GLT1-PGK1GLN1-PGK1)的甘油產(chǎn)量與野生型相比有降低趨勢(shì)，

4、但乙醇產(chǎn)量沒(méi)有升高的趨勢(shì)。GPD1和GPD2同時(shí)被缺失的ZAL809(fps1△∷LEU2gpd1△∷URAgpd2△∷URAGLT1-PGK1GLN1-PGK1)和ZAL912(gpd1△∷URA3gpd2△∷URA3GLT1-PGK1GLN1-PGK1)這兩株突變株雖然沒(méi)有甘油產(chǎn)生，但是其乙醇產(chǎn)量不僅沒(méi)有提高，相反，有明顯下降趨勢(shì)，這可能與GLN1和GLT1的表達(dá)量不足有關(guān)。 本文還介紹了質(zhì)粒pUC18-RYUR的構(gòu)建，利用