宇佐美曲霉木聚糖酶的分離純化和基因克隆.pdf

1、本論文系統(tǒng)地研究了宇佐美曲霉(Aspergillususamii)木聚糖酶(Xylanase)的分離純化、理化性質(zhì)和酶學(xué)性質(zhì)、以及木聚糖酶基因克隆和序列分析。 采用硫酸銨鹽析，Phenyl-SepharoseCL-4B疏水層析，SephadexG-50凝膠層析和DEAE-Sepharosefastflow陰離子交換層析等分離技術(shù)，從宇佐美曲霉E001固態(tài)培養(yǎng)物浸出液中分離出一種SDS-PAGE電泳純木聚糖酶組分，其最終的收率是1

2、9.0％，純化倍數(shù)是26.9，比酶活達(dá)2904.9IU/mg。通過(guò)高壓液相色譜對(duì)純化出的木聚糖酶進(jìn)行純度鑒定，獲得單一的蛋白峰。 對(duì)純化出的木聚糖酶進(jìn)行理化性質(zhì)和酶學(xué)性質(zhì)的研究，結(jié)果如下：SDS-PAGE和凝膠過(guò)濾(SephadexG-75)分別測(cè)得該木聚糖酶的分子量為20.7kD和19.4kD，表明該酶蛋白以單體形式存在。通過(guò)等電聚焦法測(cè)得的等電點(diǎn)為pI5.0。含糖量0.42％。該酶最適作用溫度50℃，在50℃以下較穩(wěn)定；最適

3、作用pH5.0，在pH5.5～9.0時(shí)穩(wěn)定。Ca2+對(duì)該酶活性有一定的激活作用，而pb2+，Sn2+，Cu2+，Al3+則有較強(qiáng)的抑制作用。以樺木木聚糖為底物，測(cè)得該酶的Km值和Vmax分別為3.5mg/ml和5000μmol/(min·mg)。 以宇佐美曲霉為出發(fā)菌株，通過(guò)對(duì)GenBank登錄的黑曲霉來(lái)源的p-1，4-木聚糖酶同源性分析，根據(jù)其保守區(qū)和真核生物mRNA在3’端具有poly(A)等所提供的信息，設(shè)計(jì)并合成PCR引

4、物，利用RT-PCR技術(shù)擴(kuò)增了木聚糖酶成熟肽編碼區(qū)和3’端非編碼區(qū)的cDNA，并將PCR產(chǎn)物直接克隆至pUCm-T載體中。序列分析表明，該木聚糖酶成熟蛋白含有188個(gè)氨基酸。進(jìn)一步采用SMARTTMPCRcDNA技術(shù)，擴(kuò)增、克隆和測(cè)定了自mRNA轉(zhuǎn)錄起始點(diǎn)至部分編碼區(qū)的cDNA片段，從而完成了木聚糖酶完整cDNA的分析測(cè)定，其中，5’非編碼區(qū)為97bp，3’非編碼區(qū)為106bp，成熟肽(含信號(hào)肽)編碼區(qū)為678bp。 分別在cD