殼聚糖酶的分離純化和性能研究.pdf

1、本文重點討論了從殼聚糖粗酶液中分離提純得到殼聚糖酶的整個過程,研究了純化的殼聚糖酶的酶學(xué)性質(zhì),并探索了混合酶法和內(nèi)切酶法制備相對分子質(zhì)量50 kDa的殼低聚糖的過程。首先探索了從Penicillium sp.ZD-Z1菌體發(fā)酵液中分離提純殼聚糖酶的過程。采用超濾法,以截留分子量2 kDa的超濾膜對發(fā)酵得到的粗酶液進(jìn)行濃縮。采用冰乙醇沉淀的方法從濃縮粗酶液中分離得到殼聚糖酶沉淀。比較了使用陰、陽兩種強(qiáng)離子交換劑下得到的殼聚糖酶分離效果,分

2、離得到兩種殼聚糖酶ChA和ChB。使用Sephadex G-50對ChA進(jìn)行進(jìn)一步純化,最終得到ChA的收率為10.5％,純化倍數(shù)20.8,50℃條件下比活475.5 U/mg;ChB的收率為9.4%,純化倍數(shù)2.9,50℃條件下比活67.5 U/mg。然后對兩種殼聚糖酶的酶學(xué)性質(zhì)進(jìn)行測試。采用等電聚焦的方法測定得ChA和ChB的等電點分別為5.21和5.92。使用凝膠過濾法測得ChA和ChB的相對分子質(zhì)量分別為64 kDa和74 kD

3、a;采用SDS-PAGE法測得ChA和ChB的相對分子質(zhì)量分別為43 kDa和115 kDa。在30 min內(nèi),以1%殼聚糖溶液作為底物,ChA的最適反應(yīng)pH為5.0,最適反應(yīng)溫度為65℃;ChB的最適反應(yīng)pH為5.5,最適反應(yīng)溫度為60℃。在50℃以下,ChA的熱穩(wěn)定性較強(qiáng),2 h以后仍能夠保持75%以上的活性;ChB在55℃以下保溫2 h仍能夠保持90%以上的活性。8種金屬離子在1 mM和0.1 mM下,對ChA的酶解均有一定的促進(jìn)

4、作用;對ChB的活性有一定的抑制作用(Co2+除外)。隨著底物殼聚糖脫乙酰度的升高,ChA和ChB的活性均逐漸增強(qiáng)。采用紙層析和HPLC方法檢測兩種殼聚糖酶的降解產(chǎn)物,確定ChA為內(nèi)切酶,ChB為外切酶。最后初步探索了以混合酶法和內(nèi)切酶法分別降解制備相對分子質(zhì)量為50kDa的殼低聚糖。建立了以特性粘度法測試殼聚糖相對分子質(zhì)量的標(biāo)準(zhǔn)曲線,如MHS方程表述:[η]=3.72×10-5Mw1.37。以混合酶降解制備相對分子質(zhì)量50kDa的殼低