產(chǎn)殼聚糖酶菌株的篩選、發(fā)酵條件優(yōu)化以及殼聚糖降解酶類(lèi)研究.pdf

1、微生物酶法降解殼聚糖制備殼寡糖、氨基葡萄糖具有反應(yīng)溫和，產(chǎn)物均一，無(wú)污染等特性，因此在工業(yè)生產(chǎn)中得到廣泛應(yīng)用。本實(shí)驗(yàn)主要研究了殼聚糖酶和外切氨基葡萄糖苷酶。主要研究結(jié)果如下：
　　(1)本實(shí)驗(yàn)選擇含有蝦蟹豐富的海灘作為分離源，采用以水溶性殼聚糖為唯一碳源的平板進(jìn)行初篩，搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)進(jìn)行復(fù)篩，DNS法測(cè)定酶活力，選出一株高產(chǎn)殼聚糖酶的菌株A502，通過(guò)形態(tài)學(xué)鑒定，16S rDNA鑒定，初步鑒定出該菌株屬于微桿菌屬(Microbact

2、erium sp.)。
　　(2)通過(guò)單因子試驗(yàn)和正交試驗(yàn)，完成了菌株A502發(fā)酵產(chǎn)酶條件的優(yōu)化，得出產(chǎn)殼聚糖酶的最優(yōu)發(fā)酵條件，發(fā)酵培養(yǎng)基(％，w/v)：1.0殼聚糖+0.1葡萄糖，1.0硫酸銨，0.14 K2HPO4·3H2O,0.5 NaCl，0.13 MgSO4·7H2O,0.03 KH2PO4，0.3酵母浸粉；培養(yǎng)基起始pH為5.5，以4%(v/v)的接種量，在30℃下發(fā)酵培養(yǎng)96 h，發(fā)酵上清酶液的活力，最高可達(dá)到124

3、 U/mL，高于其它菌株的殼聚糖酶活力。
　　(3)通過(guò)對(duì)殼聚糖酶的酶學(xué)性質(zhì)研究，發(fā)現(xiàn)酶的最適溫度是50℃，最適pH是6.0，殼聚糖酶熱穩(wěn)定性不高。Mn2+對(duì)殼聚糖酶有顯著的激活作用，Cu2+、Fe2+、Fe3+則對(duì)酶有明顯的抑制作用，而Ca2+的濃度是5 mmol/L時(shí)，對(duì)酶活性的抑制作用顯著。SDS嚴(yán)重抑制酶活性，而EDTA對(duì)酶活性的抑制較弱。
　　(4)通過(guò)對(duì)殼聚糖酶酶解條件的研究，得出酶促反應(yīng)的最適條件：在12 mL

4、的總反應(yīng)體系中，依次加入底物濃度為10%(w/v)的殼聚糖醋酸溶液10 mL，0.4 mL酶解液(45 U/mL酶液)，H2O1.6 mL，50℃反應(yīng)6 h。
　　(5)通過(guò)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)將嗜熱古菌Pyrococcus furiosus外切氨基葡萄糖苷酶進(jìn)行克隆，并將基因 PF0363連接到表達(dá)載粒 pET15b上，構(gòu)建重組質(zhì)粒pET15b-PF0363，并將其在E. coli BL21-codonPlus(DE3) RIL中表達(dá)