殼聚糖酶分離純化、性質(zhì)及降解產(chǎn)物殼寡糖制備與分析.pdf

1、殼聚糖酶是一種專一性降解殼聚糖的水解酶，可用于制備功能性的殼寡糖，又可作為生物控制劑，提高植物的抗病能力。 從本實驗室保存菌株出發(fā)，在溫度30℃，轉(zhuǎn)速100rpm，pH6.0，通氣量8L/min條件下進行發(fā)酵罐放大發(fā)酵培養(yǎng)，72小時后酶活達(dá)24U/mL。發(fā)酵粗酶液經(jīng)離心，20％～70％硫酸銨分級鹽析，Q-SepharoseFastFlow陰離子交換、SephacrylS-100凝膠過濾后，得到電泳純的殼聚糖酶，純化后酶的比活力

2、為1336U/mg，純化了28.9倍。酶的性質(zhì)研究表明，其分子量為66.2kD，酶解最適溫度為55℃，最適pH為6.0。該酶在45℃以下穩(wěn)定，4℃冷藏15天后酶活保持在95％。Mn2+對酶活有促進作用，Cu2+，F(xiàn)e3+，hg2+對酶活有抑制作用，小分子物質(zhì)EDTA與SDS對酶活有抑制作用，而IAA和β-巰基乙醇對酶活稍有促進作用。該殼聚糖酶為專一性酶，動力學(xué)參數(shù)Km值為5.15mg/mL。此酶的活性明顯高于已報道的其他殼聚糖酶，通過此

3、酶大規(guī)模生產(chǎn)殼寡糖在工業(yè)生產(chǎn)上極有應(yīng)用價值。 對酶降解法制備殼寡糖的生產(chǎn)工藝進行研究，分別考察了溫度、pH、底物濃度、脫乙酰度、酶用量、反應(yīng)時間對酶促反應(yīng)的影響。酶解產(chǎn)物進行HPLC分析，通過Bio-GelP4柱對酶解產(chǎn)物進行初步分離，并對分離產(chǎn)物TLC分析。結(jié)果表明，此酶是一種內(nèi)切酶，以內(nèi)切方式水解殼聚糖β-(1，4)糖苷鍵，降解的最佳溫度為45℃，最佳pH6.0，最佳底物濃度為6％(w/v)，HPLC顯示脫乙酰度的提高酶降

4、解產(chǎn)物數(shù)均分子量將降低，9.08U酶液至少能降解1g殼聚糖底物(5cp，DD90％)，24h后酶解反應(yīng)達(dá)到平衡。用P4柱分離得到聚合度20以上、10～20、10以下的殼寡糖。在以上最佳條件下酶解得到一批殼寡糖，對其部分質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)進行評價，具體如下：外觀，淡黃色粉末；pH7.35；水溶性，＞99.％；水分，12.1％；灰分，1.65％；重金屬鉛含量2.06ppm；平均分子質(zhì)量：2400。 對YJ02菌株的發(fā)酵液的生物學(xué)功能進行初步