β-甘露聚糖酶基因和牛凝乳酶基因黑曲霉工程菌的構(gòu)建.pdf

1、β-甘露聚糖酶(endo-1，4-β-D-mannanase; mannohydrolase; EC3.2.1.78)是一類半纖維素酶類，能夠水解甘露聚糖中的β-1，4-D-甘露糖苷鍵，廣泛存在與動植物和微生物中。β-甘露聚糖酶在食品、飼料、造紙、洗滌、石油開采及生物研究技術(shù)等方面得到廣泛應用。美國ChemGen公司開發(fā)的β-甘露聚糖酶產(chǎn)品“和美酵素”，其售價高達60萬元/t。因此，要打破國外公司對國內(nèi)市場的價格壟斷，實現(xiàn)β-甘露聚糖酶

2、的大規(guī)模應用，通過基因工程手段表達β-甘露聚糖酶是解決這一問題的有效途徑。
　　 凝乳酶可以引起蛋白質(zhì)凝聚，導致牛奶凝結(jié)，是奶酪工業(yè)化生產(chǎn)的關(guān)鍵酶。凝乳酶主要是從小牛皺胃中獲取的，由于乳酪需求不斷加大，造成全球小牛短缺使得凝乳酶的來源并不穩(wěn)定，為了解決這一矛盾，國外相繼開展了牛凝乳酶基因工程的研究并獲得了良好的經(jīng)濟效益。
　　 本研究以糖化酶生產(chǎn)菌株黑曲霉CICC2462為受體菌，針對高表達的糖化酶基因（glaA）位點，

3、構(gòu)建黑曲霉表達載體pSZH-MAN和融合表達載體pSZH-GCYM，采用農(nóng)桿菌介導法對黑曲霉進行遺傳轉(zhuǎn)化，以期實現(xiàn)目的基因的高效分泌表達，從而為構(gòu)建安全高效的黑曲霉工程菌奠定了基礎(chǔ)。此研究為簡化β-甘露聚糖酶、牛凝乳酶發(fā)酵生產(chǎn)工藝，提高β-甘露聚糖酶、牛凝乳酶產(chǎn)量提供了新的途徑。
　　 主要研究結(jié)果如下:
　　 1.β-甘露聚糖酶基因在黑曲霉中的表達采用PCR方法，以黑曲霉CICC2462的基因組DNA為模板，克隆得到1

4、275bp的β-甘露聚糖酶基因(MAN)，將MAN基因與glaA基因的5'、3'同源臂進行重疊延伸PCR，構(gòu)建MAN基因的重組表達框GMG。將此表達框插入黑曲霉表達載體pSZH-CYM中，構(gòu)建黑曲霉重組表達載體pSZH-MAN。將載體pSZH-MAN通過農(nóng)桿菌介導法轉(zhuǎn)化黑曲霉CICC2462，經(jīng)潮霉素篩選和PCR鑒定獲得4株重組菌株。并從其中篩選出在glaA基因位點發(fā)生基因置換的同源重組菌株1株。而后通過連續(xù)傳代、篩選和PCR檢測，獲得

5、了純合的同源重組菌株。對重組菌株進行發(fā)酵培養(yǎng)、酶活性檢測和SDS-PAGE分析，表明在糖化酶搖瓶發(fā)酵條件下，重組菌株培養(yǎng)液上清的β-甘露聚糖酶活性最高可達12467.2U/mL，是出發(fā)菌株的72倍，是生產(chǎn)水平的12-15倍。此研究為簡化β-甘露聚糖酶發(fā)酵生產(chǎn)工藝、提高產(chǎn)量提供了新的途徑。
　　 2.牛凝乳酶基因在黑曲霉中的表達通過農(nóng)桿菌介導法將本實驗室已構(gòu)建好的黑曲霉表達載體pSZH-CYM轉(zhuǎn)化黑曲霉CICC2462。經(jīng)潮霉素篩

6、選和PCR鑒定獲得3株重組菌株。并從其中篩選出在glaA基因位點發(fā)生基因置換的同源重組菌株1株。而后通過連續(xù)傳代、篩選和PCR檢測，獲得了純合的同源重組菌株。對重組菌株進行發(fā)酵培養(yǎng)、酶活性檢測結(jié)果表明CYM基因在黑曲霉CICC2462中得到了表達，酶活最高可達960u/mL。
　　 為了進一步提高牛凝乳酶基因(CYM)在黑曲霉CICC2462中的表達量，將CYM基因與黑曲霉CICC2462高表達glaA基因進行融合表達。構(gòu)建黑曲