β-甘露聚糖酶產(chǎn)生菌的篩選及基因的克隆與表達(dá)研究.pdf

1、半纖維素是一類可再生能源物質(zhì)，其總量占植物干重1/4～1/3，僅次于纖維素，其分解利用對(duì)于解決未來(lái)能源危機(jī)與環(huán)境問(wèn)題意義重大。對(duì)半纖維素分解過(guò)程中酶促反應(yīng)的研究以及酶的篩選一直是研究熱點(diǎn)。本研究以采集的土壤樣品為實(shí)驗(yàn)材料，經(jīng)過(guò)富集培養(yǎng)及分離純化，篩選出兩株產(chǎn)β-甘露聚糖酶的菌株。采用搖瓶培養(yǎng)分別測(cè)定其酶活力，其中二號(hào)株菌株酶活力較高，酶活力達(dá)271.85U/mL，是一號(hào)菌株的5.39倍。經(jīng)生理生化鑒定及16S rDNA序列相似性比較確定

2、一號(hào)菌株為假單孢菌(Pseudomonas sp.)，二號(hào)菌株為枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)。
　　 對(duì)這兩株產(chǎn)酶菌株的最適條件研究發(fā)現(xiàn)：假單胞菌以1g/100mL玉米粉，2g/100mL魔芋粉，pH6.0，32℃為最優(yōu)產(chǎn)酶條件，酶活力達(dá)185.37U/mL，是優(yōu)化前的3.68倍。該菌產(chǎn)酶迅速，培養(yǎng)12h已達(dá)產(chǎn)酶高峰。該酶是一種酸性的β-甘露聚糖酶，作用的最適pH為4.0，最適反應(yīng)溫度為55℃；pH穩(wěn)定性較

3、好，在pH4.0～6.0較穩(wěn)定。該酶的作用溫度范圍較寬，在40℃～55℃酶活力保持穩(wěn)定。
　　 枯草芽孢桿菌以1g/100mL酵母粉，2g/100mL魔芋粉，pH6.0，32℃為最優(yōu)產(chǎn)酶條件，酶活力達(dá)1231.41U/mL，是優(yōu)化前的4.53倍，已達(dá)到同類酶中的較高水平。該枯草芽孢桿菌產(chǎn)酶時(shí)間短，發(fā)酵培養(yǎng)9h已達(dá)產(chǎn)酶高峰，比其他常見(jiàn)菌株的產(chǎn)酶周期明顯縮短。該酶是一種酸性的β-甘露聚糖酶，作用的最適pH為5.0，最適反應(yīng)溫度為35

4、℃；pH穩(wěn)定性好，穩(wěn)定范圍較寬，在pH4.0～8.0酶活力變化不大；該酶作用的溫度范圍寬，在35℃～65℃酶活力保持穩(wěn)定，有很高的工業(yè)利用價(jià)值。
　　 本研究根據(jù)已分離的甘露聚糖酶基因特點(diǎn)，結(jié)合已發(fā)表的枯草桿菌β-甘露聚糖酶基因序列的特點(diǎn)設(shè)計(jì)特異性引物，成功的擴(kuò)增出該基因的全長(zhǎng)序列。將β-甘露聚糖酶基因man克隆到原核表達(dá)載體pET-32a上，得到重組質(zhì)粒pET-32a-man，然后轉(zhuǎn)化到大腸桿菌BL21(DE3)中，用1mMI