脫氧核糖醛縮酶同源基因的克隆、過表達(dá)與分子模擬研究.pdf

1、本文采用基因采礦方法從Genbank中選取八種革蘭氏陽性菌，以其基因組中預(yù)測的2-脫氧-D-核糖-5-磷酸醛縮酶（DERA）作為研究目標(biāo)，用PCR方法擴(kuò)增了編碼BamDERA，GthDERA，SepDERA，BthDERA，LmoDERA，BsuDERA，CaceDERA，BliDERA的基因，在大腸桿菌BL21中實(shí)現(xiàn)過量表達(dá)，并考察了熱穩(wěn)定性和最優(yōu)pH。八種來源于革蘭氏陽性菌的DERA在70℃仍然保持40～100％的活性，尤其100℃

2、下加熱10min后，GthDERA能保持77%的活性，而來源于E.coli K12的野生型DERA(EcoDERA)大于60℃時活性顯著降低。這八種DERA催化天然底物2-脫氧-D-核糖-5-磷酸（DRP）裂解反應(yīng)的活性和EcoDERA接近，但對非磷酸化底物2-脫氧-D-核糖(DR)的催化能力要遠(yuǎn)大于EcoDERA，八個酶對兩種底物的專一性常數(shù)之比([kcat/Km(DR)]/[kcat/Km(DRP)])均比EcoDERA高兩到三個數(shù)

3、量級。
　　 同源建模成功構(gòu)建了八個DERA的結(jié)構(gòu)，經(jīng)序列比對和活性位點(diǎn)疊加發(fā)現(xiàn)幾種酶底物結(jié)合位點(diǎn)具有相似的結(jié)構(gòu)特征，EcoDERA中組成磷酸結(jié)合袋子的大部分殘基在幾個克隆的DERA中是保守的，在CaceDERA中Lys172，Va1206，Arg207和Ser239分別被Phe，Ile，His和Ala取代，在BsuDERA，BliDERA和BamDERA中Lys172，Va1206和Ser239分別被Phe，Ile和Ala取代

4、，在BthDERA，LmoDERA和SepDERA中Lys172和Ser239分別被Phe和Ala取代，在GthDERA中Lys172被Phe取代，并且EcoDERA中Phe200在八個酶中均被替換為Val。分析表明這種替換可能影響底物結(jié)合位點(diǎn)靜電環(huán)境變化和兩個關(guān)鍵活性位點(diǎn)Lys殘基架構(gòu)周圍的疏水相互作用。對八個DERA和兩個底物的相互作用進(jìn)行分子對接研究，結(jié)果與實(shí)驗(yàn)結(jié)果趨勢相符，八個DERA對DR的對接打分結(jié)果要比EcoDERA高一到