GABA支路調(diào)控柑橘果實(shí)檸檬酸代謝的機(jī)理研究.pdf

1、有機(jī)酸是柑橘果實(shí)風(fēng)味品質(zhì)的重要組成成分，其含量高低與果實(shí)衰老進(jìn)程和鮮果貨架期長短緊密相關(guān)。檸檬酸是柑橘果實(shí)中最重要的有機(jī)酸，在柑橘采后貯藏過程中，有機(jī)酸會(huì)隨著呼吸和能量代謝逐漸被消耗，導(dǎo)致果實(shí)風(fēng)味品質(zhì)下降，失去商品價(jià)值。不同果實(shí)中有機(jī)酸含量的高低受遺傳、環(huán)境和栽培技術(shù)等因素共同影響;細(xì)胞內(nèi)有機(jī)酸水平受其合成、分解、轉(zhuǎn)運(yùn)和液泡貯藏綜合調(diào)控。前人關(guān)于有機(jī)酸代謝的研究大多集中在TCA循環(huán)關(guān)鍵酶的調(diào)控。近年來越來越多的研究者開始關(guān)注有機(jī)酸降解和

2、液泡貯藏對其含量的影響。γ-氨基丁酸(GABA)支路是檸檬酸降解的主要途徑之一，同時(shí)GABA代謝的最終產(chǎn)物琥珀酸又能回補(bǔ)到TCA循環(huán)，為該循環(huán)提供所需的碳骨架。因而細(xì)胞質(zhì)中合成的GABA能否進(jìn)入線粒體進(jìn)一步代謝不僅影響檸檬酸的降解，同時(shí)還可影響TCA循環(huán)的底物供應(yīng)。線粒體GABA透性酶(GABP)控制著GABA向線粒體的轉(zhuǎn)運(yùn)，是連接GABA代謝和TCA循環(huán)的閥門，但有關(guān)其對檸檬酸代謝的具體調(diào)控機(jī)制尚不清楚，以及其對GABA的轉(zhuǎn)運(yùn)引起的線

3、粒體內(nèi)外具體的生理生化反應(yīng)也缺乏系統(tǒng)的研究。本研究以不同來源的高酸和低酸柑橘果實(shí)為材料，研究GABA代謝支路對貯藏期檸檬酸含量的影響，并以柑橘GABP為切入點(diǎn)，對其調(diào)控檸檬酸代謝的機(jī)制展開深入研究，主要結(jié)果如下:
　　1.外源GABA處理可以顯著提高采后貯藏期間夏橙(Citrus sinensis Osbeck‘Valencia’)和紐荷爾（Citrus sinensis Osbeck‘Newhall’）果實(shí)中檸檬酸的含量。實(shí)驗(yàn)結(jié)

4、果表明，外源GABA處理柑橘果實(shí)，可誘導(dǎo)內(nèi)源GABA積累。基因表達(dá)分析顯示，處理可抑制GABA上游谷氨酸脫羧酶(GAD)的表達(dá)，同時(shí)在貯藏初期還降低了GABP的表達(dá)，從而抑制檸檬酸的降解。此外，與檸檬酸代謝相關(guān)的氨基酸如谷氨酸、天冬氨酸、絲氨酸、纈氨酸以及脯氨酸在處理的果實(shí)中也出現(xiàn)不同程度的積累。GABA處理提高了果實(shí)中抗氧化酶如POD的酶活性和ATP的含量;同時(shí)顯著降低了貯藏期果實(shí)的腐爛率，提高了果實(shí)的貯藏性能。與處理夏橙不同的是，G

5、ABA處理加速了紐荷爾果實(shí)果皮顏色由黃轉(zhuǎn)紅，提高了果實(shí)的貯藏品質(zhì)。GABA作為GRAS(Generally Recognized As Safe)類化合物，本研究為柑橘采后生產(chǎn)提供了一種高效且安全的采后處理方法，用以提高果實(shí)的貯藏品質(zhì)和性能。
　　2.GABA支路基因的表達(dá)活性參與決定HB(Citrus grandis Osbeck‘HiradoBuntan’)×Fairchild（Citrus reticulata×Citrus

6、 grandis‘Fairchild’）雜交群體高酸和低酸果實(shí)中的酸水平。通過連續(xù)三年對雜交群體果實(shí)進(jìn)行品質(zhì)分析，發(fā)現(xiàn)可滴定酸(TA)含量穩(wěn)定地表現(xiàn)出高于親本的特征。選取雜交群體中穩(wěn)定表現(xiàn)出最高酸和最低酸的果實(shí)進(jìn)行貯藏實(shí)驗(yàn)。結(jié)果表明，在貯藏過程中TA含量下降明顯，而可溶性固形物(TSS)含量變化不大。高酸果實(shí)中即使TA含量逐漸下降，卻仍能維持顯著高于低酸果實(shí)的特征。初生代謝物含量檢測發(fā)現(xiàn)雜交群體TA含量的超親特征主要?dú)w因于檸檬酸水平，而

7、與蘋果酸無關(guān);除了天冬氨酸和天冬酰胺之外，與檸檬酸代謝密切相關(guān)的其他氨基酸沒有表現(xiàn)出和檸檬酸含量類似的變化特征。值得注意的是，即使這些代謝物的含量在果實(shí)貯藏過程中會(huì)出現(xiàn)波動(dòng)變化，卻不改變其在高酸和低酸果實(shí)中的相對高低，說明果實(shí)發(fā)育成熟過程中積累的代謝物含量水平?jīng)Q定了其在貯藏過程中的含量高低。檸檬酸代謝相關(guān)基因的表達(dá)分析表明大部分GABA代謝支路基因以及順烏頭酸酶(Aco)的表達(dá)在高酸果實(shí)中顯著低于低酸果實(shí)，是高酸果實(shí)維持高酸含量的主要原

8、因。對果實(shí)的呼吸測定分析發(fā)現(xiàn)高酸果實(shí)的呼吸速率比低酸果實(shí)低，說明高酸果實(shí)中通過呼吸消耗的有機(jī)酸少。果實(shí)失水率測定結(jié)果表明在貯藏過程中失水率呈現(xiàn)逐漸上升的趨勢，并且與TA含量呈現(xiàn)顯著負(fù)相關(guān)關(guān)系，即高酸果實(shí)的失水率比低酸果實(shí)低，說明有機(jī)酸與水分之間存在密切聯(lián)系。本研究從遺傳背景對貯藏柑橘果實(shí)有機(jī)酸含量的影響著手，突出了GABA代謝支路活性對酸積累的決定作用。
　　3.柑橘GABA轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因（CgGABP）通過調(diào)控檸檬酸代謝相關(guān)基因的

9、表達(dá)參與調(diào)控檸檬酸代謝，且轉(zhuǎn)錄因子CgbHLH13和CgBBX32能夠通過負(fù)調(diào)控GABP的表達(dá)參與調(diào)控檸檬酸水平。以檸檬酸含量差異較大的普通高酸柑橘品種HB柚（Citrus grandis Osbeck‘Hirado Buntan’）和低酸品種無酸柚（Citrus gr andis Osbeck）為材料，同樣發(fā)現(xiàn)在高酸HB柚果實(shí)中GABA代謝支路所有基因的表達(dá)都顯著低于無酸柚，說明GABA代謝支路基因同樣參與決定HB柚和無酸柚果實(shí)中的酸

10、水平。因而以CgGABP基因?yàn)榍腥朦c(diǎn)對其進(jìn)行了功能分析及對檸檬酸代謝的調(diào)控研究。聚類分析表明CgGABP蛋白屬于氨基酸/多胺/有機(jī)陽離子(APC)超家族中雙向作用的氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(BAT)亞家族成員;拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)分析表明CgGABP與已報(bào)道的AtGABP的結(jié)構(gòu)非常相似，擁有12個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)域，并有很多保守的氨基酸殘基。亞細(xì)胞定位結(jié)果顯示CgGABP定位在線粒體中，屬于線粒體GABA轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白。
　　將CgGABP超量表達(dá)轉(zhuǎn)化番茄，成功獲得

11、轉(zhuǎn)基因番茄植株。初生代謝產(chǎn)物分析發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)基因番茄果實(shí)中檸檬酸含量明顯增加。并且轉(zhuǎn)基因番茄果實(shí)表現(xiàn)出高含量的谷氨酸、谷氨酰胺、棕櫚酸和硬脂酸，以及低含量的脯氨酸、丙氨酸、纈氨酸、天冬氨酸、天冬酰胺、琥珀酸及蔗糖。進(jìn)一步對檸檬酸代謝相關(guān)基因的表達(dá)分析顯示超量表達(dá)CgGABP可以抑制番茄內(nèi)源SlAco3a和SlAco3b的表達(dá)，誘導(dǎo)檸檬酸合酶(SlCS)和磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶(SlPEPC)基因的表達(dá)，因而促進(jìn)了檸檬酸的積累。
　　酵

12、母單雜交文庫篩選獲得與CgGABP啟動(dòng)子互作的上游調(diào)控因子，并對其蛋白結(jié)構(gòu)進(jìn)行生物信息學(xué)分析，發(fā)現(xiàn)其中一個(gè)為bHLH家族成員，命名為CgbHLH13;另一個(gè)為BBX家族成員，命名為CgBBX32。亞細(xì)胞定位實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步確定轉(zhuǎn)錄因子CgbHLH13和CgBBX32定位于細(xì)胞核中，符合轉(zhuǎn)錄因子定位特征。酵母點(diǎn)對點(diǎn)實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步證實(shí)了轉(zhuǎn)錄因子CgbHLH13和CgBBX32與CgGABP啟動(dòng)子存在互作。煙草雙熒光素酶分析發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)錄因子CgbHLH13

13、和CgBBX32負(fù)調(diào)控CgGABP的表達(dá)。超量表達(dá)轉(zhuǎn)錄因子CgbHLH13和CgBBX32轉(zhuǎn)化柑橘愈傷組織，得到2個(gè)基因的轉(zhuǎn)基因愈傷系。轉(zhuǎn)錄水平分析表明超量表達(dá)愈傷組織中GABP的表達(dá)顯著低于野生型，符合負(fù)調(diào)控特征。同時(shí)檸檬酸含量在轉(zhuǎn)基因愈傷中顯著低于野生型，并且脯氨酸、鳥氨酸、GABA、丙氨酸、纈氨酸、甘氨酸以及蔗糖含量在轉(zhuǎn)基因愈傷組織中顯著高于野生型，而谷氨酸、棕櫚酸和硬脂酸的含量顯著低于野生型，這些結(jié)果正好與超量表達(dá)CgGABP轉(zhuǎn)

14、基因番茄獲得的結(jié)果相反，符合GABP被抑制的表型。另外轉(zhuǎn)基因愈傷組織中Aco的上調(diào)表達(dá)及PEPC和CS的下調(diào)表達(dá)同樣能夠解釋檸檬酸積累的下降。此外，超量表達(dá)CgGABP激活了GABA代謝支路，而谷氨酸分解代謝主要轉(zhuǎn)向GABA代謝;相反，超量表達(dá)轉(zhuǎn)錄抑制子阻滯了GABA代謝，谷氨酸代謝主要向脯氨酸、鳥氨酸等其他路徑進(jìn)行分解代謝。本研究中，通過超量表達(dá)CgGABP基因以及超量表達(dá)CgGABP負(fù)調(diào)控因子抑制GABP表達(dá)的方法，充分證實(shí)了GAB