興安落葉松纖維素合酶基因的克隆及特性分析.pdf

1、興安落葉松（Larix gmelinii）是中國(guó)東北地區(qū)荒山造林和森林更新的主要樹種，因其材質(zhì)優(yōu)良，所以也為建筑、木材加工，木纖維工業(yè)等提供原料，具有巨大的經(jīng)濟(jì)價(jià)值。纖維素合酶（Cellμlose Synthase）是纖維素生物合成途徑中的一個(gè)關(guān)鍵酶，它的表達(dá)豐度可以直接影響到纖維素的合成，進(jìn)而對(duì)木材材質(zhì)實(shí)現(xiàn)有效調(diào)控。因此研究興安落葉松CesA基因的表達(dá)調(diào)控機(jī)理和功能特性意義非凡。
　　本研究利用兼并PCR和RACE-PCR技術(shù)分

2、離了興安落葉松纖維素合酶基因（命名為L(zhǎng)gCesA3），并對(duì)該基因的功能和表達(dá)特性進(jìn)行了分析。LgCesA3基因的cDNA全長(zhǎng)為4220bp，其中包含3297bp的開放閱讀框(ORF)、531bp的5'-UTR和392bp的3'-UTR，編碼1099個(gè)氨基酸。LgCesA3基因的DNA全長(zhǎng)為7255bp，包含14個(gè)外顯子和13個(gè)內(nèi)含子。亞細(xì)胞定位結(jié)果顯示LgCesA3∷GFP融合蛋白信號(hào)在細(xì)胞膜周圍被檢測(cè)到，因此推測(cè)LgCesA3定位于細(xì)

3、胞膜上。為了調(diào)查L(zhǎng)gCesA3的表達(dá)調(diào)控機(jī)理，利用基因組步移的技術(shù)克隆了1180bp的LgCesA3啟動(dòng)子序列。序列分析顯示，該基因的啟動(dòng)子區(qū)域包含水楊酸、茉莉酸甲酯等植物激素應(yīng)答原件，光誘導(dǎo)元件以及干旱、機(jī)械壓力等非生物脅迫相關(guān)的應(yīng)答元件。實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)結(jié)果顯示，LgCesA3在興安落葉松的根、莖、葉中均穩(wěn)定表達(dá)，莖中的表達(dá)量要遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于根和葉。同時(shí)LgCesA3基因的表達(dá)受外源激素茉莉酸甲酯和水楊酸的誘導(dǎo)，但在15％PEG和G

4、A3處理?xiàng)l件下，該基因表現(xiàn)出先升高后下降的表達(dá)趨勢(shì)。為了深入研究LgCesA3的功能和異源表達(dá)特性，構(gòu)建了pBI101-LgCesA3雙元表達(dá)載體，并通過農(nóng)瘤桿菌介導(dǎo)的花序浸染法獲得了轉(zhuǎn)基因擬南芥。RT-PCR和酶活性檢測(cè)結(jié)果證實(shí)了LgCesA3在轉(zhuǎn)基因擬南芥中的穩(wěn)定表達(dá)。超表達(dá)LgCesA3基因擬南芥的表型分析結(jié)果顯示LgCesA3基因的過量表達(dá)促進(jìn)了轉(zhuǎn)基因擬南芥植株中纖維素的積累。
　　以上研究結(jié)果表明，可通過對(duì)纖維素合成路徑