基于轉(zhuǎn)錄組分析的絞股藍氧化鯊烯環(huán)化酶的挖掘與鑒定.pdf

1、絞股藍(Gynostemma pentaphyllun(Thunb.)Makino)屬于葫蘆科絞股藍屬多年生草質(zhì)藤本植物，其主要有效成分為絞股藍皂苷，在葉片中含量最高，目前分離鑒定的絞股藍皂苷已達160余種。現(xiàn)代藥理學(xué)研究表明絞股藍皂苷具有抗腫瘤、抗焦慮、抗動脈粥樣硬化、調(diào)節(jié)免疫力、降血糖、降血脂等多種藥理活性。絞股藍皂苷屬于三萜皂苷，因與人參皂苷具有相同或相似的化學(xué)結(jié)構(gòu)而備受關(guān)注。氧化鯊烯環(huán)化酶(OSCs)是絞股藍皂苷三萜骨架結(jié)構(gòu)合成

2、的關(guān)鍵酶，本研究對絞股藍OSCs進行了克隆和鑒定，為進一步研究絞股藍皂苷的合成與調(diào)控奠定了基礎(chǔ)。
　　植物信號分子茉莉酸甲酯(MeJA)可以誘導(dǎo)絞股藍皂苷上游合成途徑中的法尼基焦磷酸合酶(FPS)和鯊烯合酶(SS)基因上調(diào)表達，因此，我們推測參與絞股藍皂苷合成的OSCs基因也可能受MeJA調(diào)控。對MeJA處理0h，6h，12h，24h的絞股藍葉的轉(zhuǎn)錄組進行了Illumina測序，共獲取202，535，156條raw reads，采

3、用de novo組裝共獲得82，073條unigenes。通過基因注釋和分類，發(fā)現(xiàn)在GO分析中，有22，662個unigenes得到注釋，其中有45個基因參與次生代謝，有2，015個基因與代謝調(diào)節(jié)有關(guān)。在KEGG分析中，總共有291個基因與萜類代謝相關(guān)，其中有82個基因與萜類骨架合成相關(guān)，有42個基因與倍半萜和三萜的生物合成相關(guān)。
　　根據(jù)序列比對和注釋結(jié)果，篩選到5個絞股藍OSCs基因，分別為GpOSC1-5。序列分析發(fā)現(xiàn)在5個

4、OSCs中能找到OSCs的保守基序DCTAE，MWCHCR和QW。利用real-time PCR技術(shù)對OSCs進行組織特異性和MeJA誘導(dǎo)表達分析，發(fā)現(xiàn)GpOSC1在絞股藍葉中高表達，其余4個基因在莖中表達量最高。MeJA對GpOSC1，4的表達具有抑制作用，GpOSC2，3，5的表達在MeJA處理的初期受到抑制，隨后表達量逐漸升高，在處理24小時后表達量達到最高。進化樹分析發(fā)現(xiàn)GpOSC1屬于β-香樹脂合酶類;GpOSC2屬于環(huán)阿屯醇

5、合酶類，與已鑒定的西葫蘆(Cucurbita pepo)環(huán)阿屯醇合酶具有87.8％的相似性;GpOSC3屬于羊毛甾醇合酶類，與絲瓜(Luffa aegyptiaca)的羊毛甾醇合酶具有77.1％的相似性;GpOSC4屬于葫蘆二烯醇合酶類，與已鑒定的葫蘆二烯醇合酶的相似性均大于80％。GpOSC5屬于isomultiflorenol合酶類，與絲瓜(Luffa aegyptiaca)中isomultiflorenol合酶的相似性達到82.3

6、％。
　　將基因GpOSC1-5分別克隆到酵母表達載體pYES2中，并轉(zhuǎn)化釀酒酵母麥角甾醇缺陷型菌株GIL77。對外源基因誘導(dǎo)48小時后，離心收集菌體，堿法裂解細胞后用正己烷提取酶的催化產(chǎn)物，通過GC-MS分析，發(fā)現(xiàn)GpOSC1能夠合成兩個特異性產(chǎn)物（產(chǎn)物1和2），GpOSC4能夠合成一個特異性產(chǎn)物（產(chǎn)物3）。通過比較保留時間和質(zhì)譜圖，發(fā)現(xiàn)這三個產(chǎn)物與標(biāo)準(zhǔn)品達瑪烯二醇Ⅱ、羽扇豆醇、葫蘆二烯醇、樺木醇和β-香樹脂等具有顯著差異。通過