大腸桿菌生產(chǎn)2,3-環(huán)氧化鯊烯研究.pdf

1、鯊烯、2,3-環(huán)氧化鯊烯是重要的醫(yī)藥中間體，也是生物體內(nèi)合成人參皂苷等具有經(jīng)濟(jì)價(jià)值萜類化合物的前體物質(zhì)。目前人參皂苷的生產(chǎn)主要依靠植物組織和細(xì)胞培養(yǎng)、植物栽培、生物轉(zhuǎn)化的方式，其生產(chǎn)效率不能滿足市場(chǎng)的需求。近年來，隨著合成生物學(xué)的發(fā)展，尤其是在微生物合成植物萜類化合物上的成功應(yīng)用，為人參皂苷的生物合成提供了可行的參考方案。大腸桿菌具有遺傳背景清楚、技術(shù)操作簡(jiǎn)單、培養(yǎng)條件簡(jiǎn)單、大規(guī)模發(fā)酵經(jīng)濟(jì)等特點(diǎn)，是優(yōu)良的外源基因表達(dá)載體。大腸桿菌的類異

2、戊二烯途徑能夠?yàn)檩祁惢衔锾峁┣绑w物質(zhì)，所以利用大腸桿菌構(gòu)建工程菌株作為生物合成植物萜類化合物的底盤具有相對(duì)的優(yōu)勢(shì)。
　　本文構(gòu)建具有鯊烯合酶表達(dá)模塊的大腸桿菌工程菌，然后以提高前體物質(zhì)法尼基焦磷酸（FPP）的積累為目標(biāo)，分別對(duì)法尼基焦磷酸合成酶基因(ispA)、異戊烯焦磷酸（IPP）異構(gòu)酶基因(idi)進(jìn)行過表達(dá)，同時(shí)對(duì)發(fā)酵條件進(jìn)行優(yōu)化，確定了以甘油為碳源、以酵母粉為氮源的發(fā)酵培養(yǎng)基,鯊烯產(chǎn)量達(dá)到6.73mg/L。
　　在

3、獲得一定的鯊烯含量后，需導(dǎo)入鯊烯環(huán)氧酶基因生產(chǎn)環(huán)氧化鯊烯。然而鯊烯環(huán)氧酶氧化鯊烯的過程需要NADPH-P450還原酶的參與，本文選取了甲基球菌鯊烯環(huán)氧酶基因和酵母鯊烯環(huán)氧酶基因兩種氧化酶基因，選取擬南芥NADPH-P450還原酶和酵母NADPH-P450還原酶兩種還原酶基因，通過不同組合，構(gòu)建表達(dá)載體進(jìn)行2,3-環(huán)氧化鯊烯的合成。
　　生物模塊的導(dǎo)入會(huì)對(duì)底盤細(xì)胞產(chǎn)生較大影響，同時(shí)外源真核基因具有跨膜結(jié)構(gòu)，導(dǎo)入大腸桿菌中并不能有效作