大腸桿菌生物合成L-2,3-二氨基丙酸.pdf

1、近年來(lái)，大腸桿菌作為一種模式生物被廣泛應(yīng)用于各種功能化合物的生產(chǎn)，氨基酸因其具有廣泛的藥用價(jià)值而備受關(guān)注。本文利用合成生物學(xué)手段，在大腸桿菌中引入L-2，3-二氨基丙酸外源路徑，首次實(shí)現(xiàn)了其生物合成，具體工作如下:
　　1、設(shè)計(jì)了三條外源合成路徑，將外源基因連接到pETDuet-1載體上，以BL21(DE3)為外源酶表達(dá)宿主。通過(guò)鎳柱純化得到三組外源酶，進(jìn)行體外酶活測(cè)試。三組外源酶中，來(lái)源于金黃色葡萄球的SbnA，SbnB能夠以谷

2、氨酸和磷酸絲氨酸為底物，將其轉(zhuǎn)化為目的產(chǎn)物L(fēng)-DAP，另外兩組酶并無(wú)活性。
　　2、將外源基因sbnA，sbnB轉(zhuǎn)入野生型BW25113成功實(shí)現(xiàn)的L-DAP的生物合成。通過(guò)內(nèi)源基因的過(guò)表達(dá)以及支路基因的敲除，進(jìn)一步提高了目標(biāo)產(chǎn)物的產(chǎn)量，L-DAP由最初的174.6mg·L-1提高到378.4mg·L-1。測(cè)試了BL21(DE3)菌株的發(fā)酵能力，并進(jìn)行菌株優(yōu)化，最終確定BW25113作為宿主菌。
　　3、將代謝路徑分為外源基因

3、與內(nèi)源基因兩個(gè)模塊，通過(guò)調(diào)控內(nèi)源基因與外源基因的表達(dá)強(qiáng)弱來(lái)進(jìn)行優(yōu)化，最終確定外源基因構(gòu)建在高拷貝的pZE12-luc載體上，內(nèi)源基因連接在中拷貝的pCS27質(zhì)粒上為最優(yōu)組合。
　　4、探究了不同酵母粉濃度下L-DAP對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)的抑制作用，發(fā)現(xiàn)添加足量的酵母粉大腸桿菌能夠恢復(fù)正常生長(zhǎng)，說(shuō)明L-DAP抑制了某些氨基酸的合成，酵母粉的加入彌補(bǔ)了氨基酸合成的不足。最后敲除了ygeX基因，并不能解除L-DAP在培養(yǎng)基中濃度的降低，說(shuō)明yge