脂肪酶產(chǎn)生菌的篩選鑒定及相關(guān)研究.pdf

1、目的：以橄欖油為唯一碳源，篩選出具有轉(zhuǎn)酯活性橄欖油的菌株，并對(duì)其進(jìn)行鑒定。①通過聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)手段擴(kuò)增得菌株體內(nèi)相應(yīng)橄欖油基因；②通過冷丙酮法提取粗酶進(jìn)行制取生物柴油的實(shí)驗(yàn)。 方法：橄欖油作為唯一的碳源來進(jìn)行富集、用具有顯色作用的指示劑來作為變色指示劑來進(jìn)行選取適合的菌株，用搖瓶含有特定培養(yǎng)基的復(fù)篩的方法獲得較高產(chǎn)脂肪酶的野生的菌株一株，并利用兩種方法，其一是平板擴(kuò)散法其二是酸堿滴定法以及轉(zhuǎn)酯的相關(guān)反應(yīng)的綜合型的技術(shù)實(shí)驗(yàn)方法，篩

2、選出具有較高轉(zhuǎn)酯活性的脂肪酶的野生菌株一株來；利用相關(guān)的實(shí)驗(yàn)室方法及冷丙酮法得到相應(yīng)的野生菌株體內(nèi)脂肪酶基因相對(duì)應(yīng)的脂肪酶，實(shí)驗(yàn)室的相關(guān)條件包括叔丁醇作為相應(yīng)溶劑，并且催化實(shí)驗(yàn)室甲醇與自行購(gòu)買的棉籽油反應(yīng)制取生物柴油；設(shè)計(jì)特定的引物來擴(kuò)增菌株體內(nèi)脂肪酶基因，有利于下一步繼續(xù)試驗(yàn)。利用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)擴(kuò)增的手段來得到兩個(gè)完整的脂肪酶的基因，制備感受態(tài)并且將目的基因轉(zhuǎn)化進(jìn)工程菌，經(jīng)由菌落聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)來檢測(cè)，最后將對(duì)篩選到的A2菌株即克雷伯氏

3、菌屬（Klebsiella sp.）在GenBank上Blast相應(yīng)脂肪酶基因，然后設(shè)計(jì)引物兩對(duì)，通過聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)擴(kuò)增出全長(zhǎng)分別為582bp和1623bp的兩個(gè)脂肪酶基因，這兩個(gè)基因都屬于克雷伯氏菌的MGH78578區(qū)段上的CDS。 結(jié)論：⑴采集不同地方的土樣，進(jìn)行了脂肪酶產(chǎn)生菌大量的篩選工作。經(jīng)以橄欖油為唯一的碳源、RhodamineB作為指示劑的平板初篩，并用搖瓶進(jìn)行復(fù)篩及酸堿滴定法測(cè)定酶活，最終篩選出一株脂肪酶產(chǎn)生菌A2

4、。菌株A2體內(nèi)產(chǎn)生的脂肪酶可以催化轉(zhuǎn)酯反應(yīng)。通過對(duì)A2進(jìn)行形態(tài)學(xué)觀察，生理生化測(cè)定初步確定A2為克雷伯氏菌屬。⑵對(duì)篩選到的A2菌株即克雷伯氏菌屬通過PCR擴(kuò)增進(jìn)行16S rDNA特征片段比較分析，證實(shí)A2菌株與克雷伯氏菌屬相似性達(dá)到99％，將測(cè)序結(jié)果序列在GenBank上注冊(cè)。⑶通過丙酮法獲得A2菌株胞內(nèi)脂肪酶，并用（NH）2SO4分級(jí)沉降法獲得菌株胞外脂肪酶，進(jìn)行酶活測(cè)定，胞外酶脂肪酶活性高于胞內(nèi)脂肪酶活性。隨后以叔丁醇作溶劑，催化棉

5、籽油與甲醇反應(yīng)制得了生物柴油。⑷對(duì)篩選到的A2菌株即克雷信氏菌屬在GenBank上Blast相應(yīng)脂肪酶基因，然后設(shè)計(jì)引物兩對(duì)，通過PCR擴(kuò)增出全長(zhǎng)分別為582bp和1623bp的兩個(gè)脂肪酶基因，這兩個(gè)基因都屬于克雷伯氏菌的MGH78578區(qū)段上的CDS。將測(cè)序結(jié)果序列在GenBank上注冊(cè)，接受號(hào)分別是FJ615553和FJ615554。⑸對(duì)A2菌株產(chǎn)酶條件的優(yōu)化，轉(zhuǎn)速在200r/min下培養(yǎng)48h產(chǎn)酶活力最高酶活力由最初的9.02U/