洋蔥伯克霍爾德菌的篩選、鑒定及其脂肪酶基因的高效表達.pdf

1、生物柴油是解決目前石化能源危機的重要途徑之一，其中脂肪酶催化法制備生物柴油技術(shù)具有反應(yīng)條件溫和、轉(zhuǎn)化效率高、綠色環(huán)保無污染等優(yōu)點，符合國家的新能源發(fā)展戰(zhàn)略，前景廣闊。但昂貴的脂肪酶價格限制了酶法生物柴油制備技術(shù)的推廣和工業(yè)化。
　　 本研究篩選到一株產(chǎn)耐熱、耐短鏈醇脂肪酶的洋蔥伯克霍爾德菌（Burholderia cepacia）G63，分子生物學鑒定其屬于B. Cenocepacia。B. Cenocepacia G63脂肪酶

2、水解橄欖油的最適pH為9.0，最適溫度為60℃，在pH 6.0-10.0以及65℃以下都十分穩(wěn)定，60℃溫育4 h后仍保留80％以上的酶活力。該酶對乙醇、丙醇和異丙醇等多種短鏈醇的耐受性極佳。這些特性表明B. Cenocepacia G63脂肪酶是催化制備生物柴油的理想用酶。搖瓶發(fā)酵的G63平均產(chǎn)酶量為12.4 U/mL。論文就提高G63脂肪酶的表達量進行了一系列分子生物學研究，B. Cenocepacia G63脂肪酶在重組大腸桿菌中

3、的表達量達到50mg/g cell-wet weight，在B. Cenocepacia同源重組工程菌BC-T7 Δliplif中水解橄欖油的酶活最高達32.7 U/mL，在畢赤酵母基因工程菌中水解pNPP酯的酶活最高達184.3 U/mL。上述結(jié)果表明本研究所建立的脂肪酶基因改造和表達技術(shù)路線是正確的。
　　 本論文的主要工作及創(chuàng)新點如下：
　　 1.建立了TB-TA平板定向篩選方法。該法篩選洋蔥伯克霍爾德菌（Burh

4、olderia cepacia）陽性率高達100％，非常適合該菌的規(guī)模化篩選。并使用HaeIII-recA RFLP（restriction fragment length polymorphism）和亞種特異性PCR的方法將G63鑒定為B. Cenocepacia，是首次鑒定到亞種水平的BCC脂肪酶生產(chǎn)菌。
　　 2.擴增了G63脂肪酶及其折疊酶的基因并在大腸桿菌中實現(xiàn)了大量表達。根據(jù)生物信息學方法對信號肽預測的結(jié)果，將脂肪酶

5、基因去除信號肽部分后在pet系統(tǒng)中表達，在胞內(nèi)表達成包涵體，隨后采用超聲波破碎、脫氧膽酸鈉溶解細胞碎片的簡單方法制備出高純度脂肪酶包涵體。蛋白質(zhì)含量測定表明脂肪酶的表達量達到50mg/g cell-wet weight。根據(jù)蛋白質(zhì)跨膜區(qū)域預測的結(jié)果，刪除折疊酶N端跨膜的70個氨基酸，成功以pet系統(tǒng)在E. Coli中實現(xiàn)折疊酶的可溶性表達，隨后利用Ni-NTA 金屬親和層析法一步純化出N端攜帶6×His 標簽的折疊酶。
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6、.進行脂肪酶的體外復性研究。證實折疊酶輔助法的復性效率明顯優(yōu)于大量稀釋法。在對折疊酶-脂肪酶摩爾比、復性pH和復性時間等因素進行研究后得出，B. Cenocepacia脂肪酶體外最佳復性條件為pH7.2，折疊酶-脂肪酶摩爾比1:1，復性時間12 h，復性后脂肪酶比活力最高為473.8 U/mg，復性效果良好。
　　 4.將T7蛋白質(zhì)表達系統(tǒng)導入B. Cenocepacia菌并實現(xiàn)了脂肪酶的高效同源表達。該系統(tǒng)以B. Cenoce

7、pacia G63為宿主菌，通過同源重組的方法把T7 RNA聚合酶基因定向插入到B. Cenocepacia基因組中脂肪酶啟動子的后面，使T7 RNA聚合酶的表達受到脂肪酶啟動子的調(diào)控，然后將受T7啟動子調(diào)控的脂肪酶基因以質(zhì)粒形式進行表達，最終實現(xiàn)了脂肪酶的高效表達。整個表達系統(tǒng)可分成T7 RNA聚合酶整合型重組菌和脂肪酶表達載體兩部分。
　　 T7重組菌的構(gòu)建通過自殺質(zhì)粒pJQ200SK介導。先把脂肪酶操縱子前后兩段500bp

8、序列分別融合到T7 RNA聚合酶基因兩端，再將此雜合基因克隆到pJQ200SK中，然后通過三親本雜交將構(gòu)建的自殺質(zhì)粒導入野生菌。自殺質(zhì)粒與野生菌基因組在500bp同源區(qū)域發(fā)生同源重組，從而將T7 RNA聚合酶基因整合于B. Cenocepacia基因組中，獲得T7重組菌。T7啟動子型表達載體共有4種，其中pBBR22lip和pBBR22liplif采用脂肪酶自身信號肽，pBBR22Δlip和pBBR22Δliplif采用pelB信號肽。

9、實驗結(jié)果表明pelB分泌信號比脂肪酶原始分泌信號更適合于脂肪酶的表達與分泌。通過電轉(zhuǎn)化將表達質(zhì)粒轉(zhuǎn)入T7重組菌獲得4種脂肪酶工程菌。B. Cenocepacia脂肪酶工程菌的這種構(gòu)建方法系本文首創(chuàng)。
　　 5.在畢赤酵母中初步實現(xiàn)了B. Cenocepacia脂肪酶的活性分泌表達。在生物信息學分析的基礎(chǔ)上，采用重疊PCR技術(shù)改造了B. Cenocepacia脂肪酶基因結(jié)構(gòu)，獲得適于在畢赤酵母中表達的優(yōu)化基因。使用pGAPZα和p