洋蔥伯克霍爾德氏菌ATCC25416胞外堿性耐高溫脂肪酶的原位表達(dá)和酶學(xué)性質(zhì)研究.pdf

1、脂肪酶(triacylglycerol lipase EC3.1.1.3)是一種廣泛存在的水解酶，能夠催化甘油三酯酯鍵的斷裂。堿性脂肪酶在堿性條件下具有很高的水解活性。由于具有反應(yīng)效率高，反應(yīng)條件溫和，安全無毒等優(yōu)點(diǎn)，堿性脂肪酶已被廣泛應(yīng)用于洗滌、制革、食品與紡織工。本論文從洋蔥伯克霍爾德氏菌(Burkholderia cepacia)ATCC25416中克隆得到胞外堿性脂肪酶全基因，并實(shí)現(xiàn)了脂肪酶基因在同源宿主中的高水平分泌表達(dá)，初步

2、分離純化后對脂肪酶酶學(xué)性質(zhì)進(jìn)行研究，為洋蔥伯克霍爾德氏菌脂肪酶的進(jìn)一步理論研究及其應(yīng)用奠定了基礎(chǔ)。此外，本論文嘗試了B.cepacia ATCC25416基因組文庫的構(gòu)建，希望通過文庫的構(gòu)建和篩選克隆得到該菌株表達(dá)的所有脂肪酶基因，對B.cepacia ATCC25416脂肪酶進(jìn)行系統(tǒng)的研究。本論文主要研究包括：
　　 (1)以實(shí)驗(yàn)室保藏菌種B.cepacia ATCC25416基因組為模板，PCR擴(kuò)增得到包含脂肪酶基因上游啟動(dòng)

3、子序列，脂肪酶基因lipA，伴侶蛋白基因lipB以及l(fā)ipB下游終止子序列，全長2333 bp。包含啟動(dòng)子的上游序列長143 bp。lipA開放閱讀框長1095 bp，編碼一個(gè)364個(gè)氨基酸殘基的蛋白質(zhì)，包括N末端44個(gè)氨基酸殘基組成的信號肽。lipB開放閱讀框長1035 bp，編碼344個(gè)氨基酸殘基的蛋白質(zhì)，包括N末端70個(gè)氨基酸殘基組成的起錨定作用的疏水序列。
　　 (2)構(gòu)建同源表達(dá)重組質(zhì)粒pBBRMCS1-lipAB，將

4、重組表達(dá)質(zhì)粒電轉(zhuǎn)化B.cepaciaATCC25416。在相同發(fā)酵條件下，比較了野生型和重組型B.cepacia ATCC25416的發(fā)酵產(chǎn)酶情況，重組菌在發(fā)酵32 h時(shí)的胞外脂肪酶活力達(dá)到最高，為142 U/mL，野生菌在發(fā)酵40 h時(shí)的胞外脂肪酶活力達(dá)到最高，為70 U/mL。此外，在不同時(shí)間段重組菌胞外脂肪酶活力均明顯高于野生菌。
　　 (3)將重組B.cepacia ATCC25416發(fā)酵上清經(jīng)過硫酸銨沉淀，疏水色譜層析

5、和陰離子交換層析后得到較純的脂肪酶活性組分LipA。SDS-PAGE分析純化后的LipA是加工過的產(chǎn)物，分泌表達(dá)的脂肪酶不含N端44個(gè)氨基酸殘基組成的信號肽，只保留了320個(gè)氨基酸殘基組成的成熟肽。分子量為33 kDa左右，與預(yù)測分子量相等。
　　 (4)通過對LipA酶學(xué)性質(zhì)的研究，發(fā)現(xiàn)其最適反應(yīng)pH和最適反應(yīng)溫度分別為11.0和60℃。該酶在30-70℃和pH9.0-11.5的環(huán)境中十分穩(wěn)定，是堿性耐高溫脂肪酶。該酶對C12

6、-C16的長鏈脂肪酸酯水解活力較高，對三油酸甘油酯沒有位置選擇性。1 mMMg2+，Ca2+，Cu2+，Zn2+和Co2+對脂肪酶具有較好的激活作用，而1 mM PMSF， EDTA以及10 mM DTT與1mM SDS混合物強(qiáng)烈抑制脂肪酶的活力。非離子型表面活性劑對酶活具有激活作用，離子型表面活性劑對酶活具有輕微抑制作用。該酶在氧化劑過氧化氫中表現(xiàn)穩(wěn)定，在低極性的苯環(huán)類有機(jī)溶劑以及非極性的烷烴類有機(jī)溶劑中有較高的活力和良好的穩(wěn)定性。<

7、br>　　 (5)基因組粘粒文庫的初步構(gòu)建確定了高分子量DNA(HMW DNA)的提取方法，用瓊脂糖凝膠包埋、裂解和純化的方法提取的基因組DNA長度遠(yuǎn)大于500 kb。考察了不同限制性內(nèi)切酶對瓊脂糖膠塊內(nèi)HMW DNA的不完全酶切作用，BamHI不完全酶切HMW DNA可以產(chǎn)生集中于20-30 kb的DNA片斷，脈沖場電泳(PFGE)能夠很好的分辨大于20 kb的DNA片斷。文庫的初步構(gòu)建為獲取高質(zhì)量粘?；蚪M文庫以及目的基因的篩選和