洋蔥伯克霍爾德菌脂肪酶的高效表達、純化及其體外復性的研究.pdf

1、生物柴油作為理想的可再生清潔能源，是解決能源危機的重要途徑之一，也是未來新能源開發(fā)的主要方向。相較于化學法，脂肪酶法制備生物柴油具有條件溫和、轉(zhuǎn)化效率高、環(huán)境友好等優(yōu)點。但脂肪酶價格昂貴，導致生物柴油成本偏高，缺乏市場競爭力，已嚴重制約著酶法生產(chǎn)生物柴油工藝的產(chǎn)業(yè)化發(fā)展。因此，制備低成本脂肪酶對于生物柴油產(chǎn)業(yè)的發(fā)展具有重大意義。
　　 本文以理想的生物柴油專用脂肪酶——洋蔥伯克霍爾德菌G63 脂肪酶為對象，擴增并表達了該脂肪酶及

2、其折疊酶基因，研究了折疊酶輔助下脂肪酶的體外復性過程，并對復性后的脂肪酶的應(yīng)用進行了初步探索。主要研究工作和結(jié)果如下：
　　 1．擴增了G63 脂肪酶及其折疊酶基因，并實現(xiàn)了二者在大腸桿菌BL21(DE3)中的高效表達。根據(jù)生物信息學方法對脂肪酶信號肽進行預(yù)測，利用pET-28a（+）質(zhì)粒對N 端刪除40個氨基酸殘基信號肽的脂肪酶進行了表達。脂肪酶胞內(nèi)表達以包涵體形式存在，利用高壓/超聲波破碎、脫氧膽酸鈉處理的洗滌純化方法制備了

3、高純度的脂肪酶包涵體，包涵體溶解于8M的脲中，包涵體蛋白質(zhì)含量達到50mg/g cell-wetweight，包涵體用尿素溶解后濃度為4.085mg/mL。對折疊酶跨膜區(qū)域進行預(yù)測，利用pET-28a(+)質(zhì)粒對N 端刪除疏水性跨膜區(qū)域的折疊酶進行表達。折疊酶融合蛋白在胞內(nèi)以可溶形式表達，表達產(chǎn)物N 端攜帶6×His 標簽，利用Ni-NTA 金屬親和層析的方法制備了高純度的折疊酶，透析除去咪唑后折疊酶的蛋白質(zhì)濃度為0.67mg/mL。<

4、br>　　 2．研究了變性脂肪酶在折疊酶的輔助下的體外復性過程。對復性過程中的折疊酶/脂肪酶摩爾比、溫度、時間、pH 及蛋白質(zhì)濃度等相關(guān)因素進行了考察，結(jié)果表明：
　　 當?shù)鞍踪|(zhì)濃度較低（0.8μg/mL）時，在復性條件（折疊酶/脂肪酶摩爾比1:1，溫度15℃，時間5小時及pH7.0）下，脂肪酶復性后比活力可達1514.0U/mg；當?shù)鞍踪|(zhì)濃度較高（80μg/mL）時，在復性條件（折疊酶/脂肪酶摩爾比1:1，溫度15℃，時間4