洋蔥假單胞菌脂肪酶在非水相介質中構效關系的研究.pdf

1、與化學催化劑相比,脂肪酶催化劑具有反應條件溫和、催化效率高、過程能耗低和環(huán)境友好等優(yōu)點,但制備成本相對較高,且易失活和穩(wěn)定性差,上述不足嚴重制約了脂肪酶的工業(yè)化應用。為解決這些問題,國內外學者嘗試通過溶劑工程和蛋白質工程等方法提高脂肪酶的活性和穩(wěn)定性,從而降低催化反應的生產成本。洋蔥假單胞菌脂肪酶(PCL)被廣泛應用于有機相催化反應,但其在非水相介質中的活力變化機制尚未完全清楚。本文以脂肪酶PCL為對象,通過溶劑工程的手段,詳細研究了5

2、種有機溶劑、19種離子液體和高壓CO2對脂肪酶活力和結構的影響,篩選出了適合脂肪酶PCL催化的最適反應介質,并初步闡釋了脂肪酶PCL在非水相介質中活力變化的內在機制;為脂肪酶PCL的生產應用提供了理論基礎和技術支撐。主要研究內容和結果摘要如下:
　　1.有機溶劑對脂肪酶PCL活力和結構的影響。研究了脂肪酶PCL在有機溶劑體系中的催化反應,40°C搖床反應12h后氣相色譜分析生物柴油得率。結果表明,生物柴油得率隨有機溶劑logP的增

3、加而降低,即脂肪酶PCL在親水性有機溶劑(叔戊醇和叔丁醇)中有較高生物柴油得率,而在疏水性有機溶劑(石油醚、正己烷和異辛烷)中則表現(xiàn)出較低活力,可能是由于反應底物與產物在親水性有機溶劑中能夠形成均一反應體系,增加了底物與酶的接觸機率,并降低了反應底物甲醇和反應產物甘油對脂肪酶的毒害作用。紅外光譜分析表明,有機溶劑對脂肪酶PCL的二級結構產生了不同程度的影響,且脂肪酶PCL活力的增加可能是由于α-螺旋含量的降低導致酶的活性中心暴露、從而使

4、酶更容易與底物接觸的緣故。熒光光譜分析表明,有機溶劑使脂肪酶PCL的三級結構也發(fā)生了變化,且蛋白質熒光強度的增加與其活力的提高成正比關系。
　　2.離子液體對脂肪酶PCL活力和結構的影響。研究了脂肪酶PCL在離子液體中的活力變化,反應底物大豆油和甲醇在40°C反應12h后,GC分析生物柴油得率。結果表明,陰離子對脂肪酶活力影響的差異性遠大于陽離子,含有疏水性陰離子[PF6]–和[Tf2N]–的離子液體適合作為反應溶劑,脂肪酶PCL

5、在兩性離子液體[Ompy][BF4]中得到最高生物柴油得率為82.3％;而脂肪酶在親水性和親核性離子液體中則表現(xiàn)出較低的催化活力,可能是由于親水性離子液體影響了脂肪酶微環(huán)境中必需水的含量,導致脂肪酶的空間構象發(fā)生了變化,而親核性離子液體則易吸附在脂肪酶活性中心附近,從而阻礙了催化中心與底物的結合。紅外光譜分析表明,脂肪酶PCL的二級結構在離子液體中發(fā)生了不同程度的變化,而脂肪酶PCL活力的增加可能是α-螺旋含量的降低使蛋白質的活性中心暴

6、露,從而使底物更容易進入。
　　3.高壓CO2對液體脂肪酶PCL催化特性的影響。研究了液體脂肪酶PCL在高壓CO2中活力、結構和穩(wěn)定性的變化,以橄欖油為反應底物,測定了高壓處理脂肪酶PCL的水解活力。實驗結果表明,壓力和溫度的增加顯著提高了液體脂肪酶的水解活力,可能是由于高壓CO2與脂肪酶的相互作用使蛋白質的結構發(fā)生變化所致。反應動力學表明,高壓處理提高了液體脂肪酶PCL的最大反應速度Vmax,降低反應的活化能Ea,但顯著降低了對

7、底物的親和力和催化效率,蛋白質的熱穩(wěn)定性和對親水性有機溶劑的耐受性也顯著性降低。SDS-PAGE表明,高壓處理沒有使蛋白質發(fā)生聚集或斷裂,說明高壓CO2對液體脂肪酶的一級結構未產生影響。圓二色和熒光光譜分析表明,6MPa/35°C處理液體脂肪酶PCL的活力變化主要是由于高壓導致蛋白質二級結構發(fā)生變化所致;而10MPa/40°C處理脂肪酶PCL的活力變化則與蛋白質二級和三級結構發(fā)生變化有關。在亞臨界和超臨界條件下,處理時間對液體脂肪酶PC

8、L的三級結構幾乎無影響。
　　4.高壓CO2對固體脂肪酶PCL催化特性的影響。采用中心實驗設計研究了壓力、溫度和處理時間對固體脂肪酶活力、結構和穩(wěn)定性的影響。實驗結果表明,亞超臨界CO2處理對固體脂肪酶PCL的活力都有不同程度的提高,最高活力分別為125.9%和130.4%,且超臨界CO2處理要明顯好于亞臨界處理,但壓力、溫度和處理時間對脂肪酶PCL的活力均沒有顯著性影響。紅外和熒光圖譜分析表明,亞臨界處理脂肪酶PCL的活力隨蛋白