嗜熱單孢菌角質酶的基因鑒定、高效表達及分子改造.pdf

1、江南大學博士學位論文嗜熱單孢菌角質酶的基因鑒定、高效表達及分子改造姓名：陳晟申請學位級別：博士專業(yè)：發(fā)酵工程指導教師：陳堅20090601摘要從周質空間向培養(yǎng)基中分泌。研究表明，在對數(shù)生長中期，添加100mM甘氨酸、1mM表面活性劑TDOC均可將酶活最高點從80h提前至54h；采取重組大腸桿菌在25oC發(fā)酵至24h時將培養(yǎng)溫度提高至37oC的變溫策略對重組蛋白的分泌有促進作用，酶活最高點出現(xiàn)于62h，比不變溫的對照提前了18h。4重組T

2、fu0882、Tfu0883和Esolanipisi角質酶在水溶液中均以單體形式存在。重組Tfu0882、Tfu0883的最適溫度為60oC，并具有良好的熱穩(wěn)定性；重組Fsolanipisi角質酶的最適溫度為40oC，熱穩(wěn)定性較差。三種角質酶的最適pH均為80，pH穩(wěn)定范圍為609。0。三種角質酶均能夠水解可溶性酯、不溶性甘油三酯和聚酯，并傾向于水解短鏈底物，沒有位置特異性。Esolanipisi角質酶對州PB底物的親和力最大，催化效率

3、最高；Esolanipisi角質酶水解PET能力最強，Tfu0883次之，Tfu0882對PET僅有微弱水解。三種角質酶都沒有界面活化現(xiàn)象，不需要二價金屬離子作為輔助因子，Mn2對三者有激活作用，CP和H92對三種角質酶有強烈抑制作用。TritonX100和Tween20抑制Tfu0882和Tfu0883的活性，對Esolanipisi角質酶無明顯作用；SDS對三種角質酶均有競爭性抑制，Tfu0882抑制最弱；TDOC對Fsolanip

4、isi角質酶有明顯激活作用。重組Tfu0882和Tfu0883在甲醇、乙醇等多種有機溶劑中具有良好的穩(wěn)定性，Esolanipisi角質酶在有機溶劑中的穩(wěn)定性較差。5以Streptomycesexfoliates脂肪酶晶體結構為模板，通過SWISSMODEL軟件模擬得到Tfu0883和Tfu0882結構模型。模型顯示，Zfusca角質酶具有典型的彰B水解酶結構，Tfu0883的活性中心由S170H248D216催化三角組成，Tfu0882

5、的活性中心由S188H266D234催化三角組成。Zfusca角質酶活性中心上方?jīng)]有蓋子結構，活性中心暴露于溶劑中。角質酶基因Flu0882和m0883在基因組中處在相鄰位置，并處于兩個不同的操縱子中，受到不同的調控。Tfu0882和Tfu0883在水解角質過程中沒有協(xié)同作用。在結構模擬的基礎上進行理性分析，并成功構建了角質酶突變體Tfu08831218A、Tfu0883W195A／F249A和Tfu0883Q132A／T101A，催化