Bt殺蟲基因cry3A在桑粒肩天牛幼蟲腸道優(yōu)勢(shì)菌和常駐菌中的轉(zhuǎn)化和表達(dá)研究.pdf

1、天牛是鞘翅目昆蟲中較大的一個(gè)類群，在世界各地廣有分布，其幼蟲大多以木質(zhì)纖維為食，林木、果樹、桑、茶、棉、木建材料、家具等都可以受到天牛的危害，林木的天牛受害率達(dá)20-90％，每年造成的經(jīng)濟(jì)損失上億元。由于天牛幼蟲營(yíng)鉆蛀性生活，生活隱蔽，活動(dòng)期長(zhǎng)，所以防治工作難度很大。目前的主要防治方法仍是以傳統(tǒng)的人工鉤殺幼蟲、砸卵、堵洞和化學(xué)藥劑防治等方法為主。其中人工防治費(fèi)時(shí)、費(fèi)工、成本又高，不適用于規(guī)模化大農(nóng)場(chǎng)生產(chǎn)；利用化學(xué)防治藥劑防治由于藥劑有效

2、期短，不易達(dá)到蟲體，而且容易導(dǎo)致害蟲抗藥性增強(qiáng)以及具有污染環(huán)境、殺傷天敵的弊端。因此，探索新的防治途徑，開發(fā)新的防治技術(shù)，已成為生產(chǎn)上的迫切要求。新的害蟲防治方法和理論完善與發(fā)展離不開昆蟲生理生化的研究。近年來，研究昆蟲腸道正常菌群和腸道微生態(tài)以探索新的害蟲控制方法正在成為國(guó)內(nèi)外研究的熱點(diǎn)之一。
　　本文用傳統(tǒng)培養(yǎng)方法和現(xiàn)代分子生物學(xué)方法－16S rDNA分析法對(duì)桑粒肩天牛幼蟲腸道微生物組成進(jìn)行了研究，在此基礎(chǔ)上，首次探索將殺蟲基

3、因轉(zhuǎn)入天牛幼蟲腸道常駐的和優(yōu)勢(shì)的正常菌群載體菌，以構(gòu)建在昆蟲腸道中高定植率、高生存力、高繁殖并能表達(dá)殺蟲毒蛋白伴孢晶體的新型殺蟲工程菌。研究將可能為害蟲的生物防治開辟一條新的途徑，為新型轉(zhuǎn)基因生物農(nóng)藥的研發(fā)提供理論依據(jù)與技術(shù)支撐。
　　主要研究結(jié)果如下：
　　①用傳統(tǒng)的培養(yǎng)方法從桑粒肩天牛幼蟲腸道中共分離鑒定出18個(gè)種的細(xì)菌，它們分別是產(chǎn)酸克雷伯氏菌(Klebsilla Oxytoca)、成團(tuán)桿菌(Enterobacter

4、cloacae)、熒光假單胞菌(Pseudomonas fluorescens)、惡臭假單胞菌(Pseudomonas putida)、弗氏志賀氏菌(Shiqella flexneri)、溶血葡萄球菌(Staphylococcus haemolyticus)、鮑氏志賀氏菌(Shiqella boydii)、人葡萄球菌(Staphylococcus homis)、藤黃微球菌(Micrococcus luteus)、Breneria que

5、rcina、無花果沙雷氏菌(Serratia ficaria)、短短芽孢桿菌(Brevibacillus brevis)、蘇云金芽孢桿菌(Bacillus thuringiensis)、大腸埃希氏菌(Escherichia coli)、Naxibacter haematophilus、產(chǎn)氣長(zhǎng)桿菌(Enterobacter aerogens)、克里斯汀微球菌(Micrococcus kristinae)、阿氏腸桿菌(Enterobacte

6、r absburiae)。其中溶血葡萄球菌(S. haemolyticus)、人葡萄球菌(S. homis)、短短芽孢桿菌(B. brevis)、蘇云金芽孢桿菌(B. thuringiensis)等在幼蟲腸道中全年均能分離到，成團(tuán)桿菌(E. cloacae)、產(chǎn)氣腸桿菌(E. aerogens)、阿氏腸桿菌(E. absburiae)可在1～2月份外的全年的大部分時(shí)間分離到，其它細(xì)菌種類則只能在4～11月份分離到，說明至少溶血葡萄球菌(

7、S. haemolyticus)、人葡萄球菌(S. homis)、短短芽孢桿菌(B. brevis)、蘇云金芽孢桿菌(B. thuringiensis)應(yīng)為天牛腸道常駐菌群，而其余種類微生物則很可能是隨進(jìn)食或與環(huán)境接觸而進(jìn)入的過路菌群。根據(jù)分離率和腸道菌群培養(yǎng)的數(shù)量統(tǒng)計(jì)結(jié)果表明天牛腸道優(yōu)勢(shì)菌群是葡萄球菌屬(Staphylococcus)細(xì)菌中的溶血葡萄球菌(S. haemolyticus)和人葡萄球菌(S. homis)，其菌量分別為7

8、.74±0.61和7.66±0.25，分離率分別為100%和98.09%。
　?、趯磦鹘y(tǒng)方法從桑粒肩天牛幼蟲腸道分離、鑒定的18個(gè)不同種的細(xì)菌作為PCR模板，進(jìn)行16S rDNA序列的分析，經(jīng)與數(shù)據(jù)庫中登錄序列比對(duì)，鑒定結(jié)果與分離培養(yǎng)方法所獲得的結(jié)果一致。所測(cè)序列與Genbank中同種細(xì)菌的16S rDNA序列相似性分別為98.58％、99.18％、97.86％、99.89％、98.02%、99.19%、99.32%、98.46

9、%、99.30%、98.05％、96.97％、98.33％、99.46％、99.60%、99.03%、99.45%、99.01%、99.52%，均高于98％，說明鑒定結(jié)果正確。所得菌株的16S rRNA都已在Genbank中登錄注冊(cè)，系統(tǒng)接受號(hào)為EU554427-EU554444。
　?、蹖⒑屑t霉素抗性基因和cry3A基因的Escherichia coli-Bacillus thuringiensis穿梭表達(dá)質(zhì)粒pHT305a和

10、pHT7911轉(zhuǎn)入桑粒肩天牛幼蟲腸道優(yōu)勢(shì)常駐菌溶血葡萄球菌(S. haemolyticus)、人葡萄球菌(S. homis)和常駐內(nèi)生菌短短芽孢桿菌(B. brevis)、蘇云金芽孢桿菌(B. thuringiensis)中，獲得的轉(zhuǎn)化子中外源基因能穩(wěn)定自主復(fù)制，而且其中用紅霉素抗性平板篩選出的常駐內(nèi)生工程菌轉(zhuǎn)化子在產(chǎn)伴孢晶體發(fā)酵培養(yǎng)基中培養(yǎng)至90%以上芽孢脫落晶體釋放時(shí)的菌液可提取到經(jīng)SDS-PAGE分析分子量為65KDa的伴孢晶體蛋